發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 16:22

【摘要】：目的： 通過(guò)體外培養(yǎng)獲得人牙齦成纖維細(xì)胞(Human gingival fibroblasts,HGFs),采用高濃度葡萄糖、牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激,酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)HGFs分泌腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-α, TNF-α)和白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)的水平,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Toll樣受體2(Toll-like receptor2, TLR2)和Toll樣受體4(Toll-like receptor4, TLR4)在HGFs中的表達(dá),并用anti-TLR2和anti-TLR4單克隆抗體阻斷后觀察IL-1β和TNF-α水平的變化,以期初步探討高糖對(duì)P.g LPS刺激HGFs分泌炎癥細(xì)胞因子的作用及其機(jī)制,為闡明糖尿病性牙周炎的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.在天津醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院頜面外科選擇第三磨牙阻生齒完全埋伏、身體健康的患者5例(年齡18-25歲),獲得患者的知情同意后,在智齒拔除過(guò)程中收集牙齦。用無(wú)菌中性蛋白分散酶(Dispase Ⅱ)消化分離牙齦上皮后,組織塊法培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞,倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)及生長(zhǎng)狀況。 2.采用ELISA檢測(cè)高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激6h和12h后細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-1β水平的變化,以低糖組、P.g LPS/低糖刺激組作對(duì)照。 3.以高糖、P.g LPS (1μg/ml、10μg/ml)和高糖/P.g LPS刺激HGFs6h和12h后,采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TLR2和TLR4在HGFs中的表達(dá)水平,設(shè)低糖組、P.g LPS/低糖刺激組作對(duì)照。 4.應(yīng)用anti-TLR2和anti-TLR4的單克隆抗體對(duì)HGFs表面的TLR.2、4進(jìn)行阻斷,用高糖或P.g LPS/高糖刺激HGFs12h后,以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)TNF-α、IL-1β的水平,設(shè)高糖或P.g LPS/高糖刺激作對(duì)照組。 結(jié)果： 1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞培養(yǎng)至第7-10天,少數(shù)長(zhǎng)梭形細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,并圍繞組織塊呈放射狀排列,傳代后細(xì)胞生長(zhǎng)迅速。 2.與低糖對(duì)照組相比,高糖刺激6h后TNF-α分泌增加且隨著時(shí)間延長(zhǎng),TNF-α分泌明顯增加,呈時(shí)間依賴(lài)性(p0.05)。雖然IL-1p水平在6h沒(méi)有明顯增加,但在12h時(shí)顯著升高(p0.05)。滲透壓對(duì)照組與低糖對(duì)照組相比,TNF-α和IL-1β水平?jīng)]有明顯變化。 3.與低糖對(duì)照組相比,高糖刺激6h時(shí)TLR2mRNA表達(dá)明顯升高(p0.05),在12h時(shí)升高更加明顯(p0.05)。而在不同的時(shí)間下高糖對(duì)TLR4的表達(dá)刺激效應(yīng)無(wú)差異(p0.05)。滲透壓對(duì)照組與低糖對(duì)照組相比TLR2和TLR4mRNA水平差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。 4.采用anti-TLR2單克隆抗體預(yù)先處理HGFs后,高糖刺激HGFs產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β水平明顯下降(p0.05),而anti-TLR4抗體預(yù)處理后TNF-α、IL-1β水平變化無(wú)顯著差異(p0.05)。 5.與低糖組相比較,P.g LPS/低糖刺激HGFs6h和12h后,TLR2的表達(dá)和炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β分泌顯著升高,呈濃度依賴(lài)性(p0.05),而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)TNF-α、IL-1β分泌明顯增加(p0.05)。TLR4在P.g LPS/低糖刺激HGFs6h后的表達(dá)明顯升高(p0.05),但P.g LPS刺激細(xì)胞12h后,TLR4的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差別(p0.05)。 6.與LPS/低糖刺激組比較,高糖可明顯促進(jìn)LPS刺激HGFs表面TLR2、4的表達(dá),同時(shí)顯著促進(jìn)炎癥因子IL-1β、TNF-α的分泌(p0.05)。采用anti-TLR2單克隆抗體、anti-TLR4抗體預(yù)先處理HGFs后,P.g LPS/高糖刺激HGFs12h產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β水平明顯下降(p0.05)。 結(jié)論： 1.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)HGFs方法簡(jiǎn)單,組織定位明確,組織塊貼壁是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。 2.高糖可通過(guò)誘導(dǎo)HGFs表面TLR2mRNA的表達(dá)升高,從而促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1p的分泌。而TLR4不參與單純高糖刺激炎癥細(xì)胞因子的分泌過(guò)程。 3. P.g LPS促進(jìn)HGFs產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子,早期可能主要通過(guò)其表面的TLR2和TLR4來(lái)介導(dǎo)炎癥細(xì)胞因子的分泌,隨后主要通過(guò)其表面的TLR2來(lái)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 4.高糖可明顯促進(jìn)P.g LPS刺激HGFs表面TLR2和TLR4mRNA的表達(dá)及炎癥細(xì)胞因子的分泌,從而在一定程度上證實(shí)糖尿病患者血糖升高可加重牙周炎癥。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R781.42;R587.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 付永偉;和紅兵;歐炯光;;糖尿病性牙周炎與細(xì)胞凋亡[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年02期

本文編號(hào)：2746770