【摘要】：目的：通過體外實驗觀察白念珠菌與KB細(xì)胞的黏附情況，探討白念珠菌對口腔上皮細(xì)胞的黏附作用和影響因素，進一步分析白念珠菌的致病機制；應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）分別檢測白細(xì)胞介素-6（IL-6）在KB細(xì)胞中的蛋白和mRNA表達以及白念珠菌感染后對其表達的影響，探討IL-6在口腔上皮細(xì)胞早期防御白念珠菌感染中的可能作用。 方法：以口腔鱗癌細(xì)胞系KB細(xì)胞為研究對象，觀察白念珠菌感染KB細(xì)胞后，在不同的時間，白念珠菌的黏附總數(shù)、活力、及菌絲轉(zhuǎn)換情況；分別以白念珠菌的菌絲相、孢子相和滅活的白念珠菌感染KB細(xì)胞，以單獨培養(yǎng)的KB細(xì)胞作為對照組，分別在6h、12h、24h提取培養(yǎng)上清液，ELISA法檢測上清液中IL-6的蛋白含量；RT-PCR法檢測白念珠菌感染KB細(xì)胞后在24h時IL-6mRNA表達水平。 結(jié)果：1.白念珠菌感染KB細(xì)胞后發(fā)生細(xì)胞黏附，24h內(nèi)，隨著時間的推移，被黏附的KB細(xì)胞數(shù)逐漸增多，孢子相和菌絲相白念珠菌均可黏附KB細(xì)胞。2.白念珠菌黏附KB細(xì)胞后，念珠菌仍保持其活性，但是隨著時間的推移，游離態(tài)念珠菌的總數(shù)逐漸減少，從感染3小時后的1.5×105candida cells/cm~2減少到24小時后的8×103candida cells/cm~2。3.白念珠菌感染KB細(xì)胞后，其形態(tài)從孢子相逐漸向菌絲相進行轉(zhuǎn)換。并且隨著時間的推移，菌絲的轉(zhuǎn)換率逐漸升高，由3小時后的23.1%升高到24小時后的82.2%。差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。4.白念珠菌感染KB細(xì)胞后表達IL-6的蛋白含量隨時間的增加而增加，12h達到高峰，隨后出現(xiàn)下降趨勢，白念珠菌孢子相和菌絲相感染KB細(xì)胞后IL-6的蛋白表達含量與對照組比較，P0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。5. RT-PCR成像分析系統(tǒng)顯示，孢子相和菌絲相白念珠菌黏附KB細(xì)胞后均可使IL-6mRNA的表達增加而且顯著高于對照組，P0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：1.白念珠菌感染KB細(xì)胞后，被黏附的KB細(xì)胞數(shù)與游離態(tài)白念珠菌的總數(shù)均具有時間依賴性。白念珠菌的菌絲轉(zhuǎn)換率與時間呈正相關(guān)。2.白念珠菌感染KB細(xì)胞后IL-6的蛋白表達上調(diào)，且表達的含量與時間具有依賴關(guān)系。3.白念珠菌感染KB細(xì)胞后IL-6的mRNA表達上調(diào)，提示上皮細(xì)胞可能參與白念珠菌的免疫反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R780.2
【圖文】：

取5μl PCR產(chǎn)物與1μl上樣液，混勻后加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，以DL1000作為相對分子質(zhì)量Marker，電壓為80 v，電泳約40分鐘，取出凝膠置于凝膠成像分析儀中成像，用Gel-Pro analyze做條帶灰度分析，以IL-6mRNA與GAPDH mRNA條帶灰度比值來檢測樣本中IL-6mRNA的相對表達量。（六）結(jié)果統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)用 ±S 表示，經(jīng) SPSS11.5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用單因素方差分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果一.白念珠菌與 KB 細(xì)胞的黏附（一）白念珠菌黏附 KB 細(xì)胞的顯微鏡下觀察正常的 KB 細(xì)胞是扁平的多角形，在胞質(zhì)靠近中央處有圓形的細(xì)胞核，各個細(xì)胞間緊密相連，彼此互相銜接，呈現(xiàn)“鋪路石”狀。4. PCR產(chǎn)物半定量分析

取5μl PCR產(chǎn)物與1μl上樣液，混勻后加入2%瓊脂糖凝膠加樣孔中，以DL1000作為相對分子質(zhì)量Marker，電壓為80 v，電泳約40分鐘，取出凝膠置于凝膠成像分析儀中成像，用Gel-Pro analyze做條帶灰度分析，以IL-6mRNA與GAPDH mRNA條帶灰度比值來檢測樣本中IL-6mRNA的相對表達量。（六）結(jié)果統(tǒng)計分析所得數(shù)據(jù)用 ±S 表示，經(jīng) SPSS11.5 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。采用單因素方差分析，P<0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié) 果一.白念珠菌與 KB 細(xì)胞的黏附（一）白念珠菌黏附 KB 細(xì)胞的顯微鏡下觀察正常的 KB 細(xì)胞是扁平的多角形，在胞質(zhì)靠近中央處有圓形的細(xì)胞核，各個細(xì)胞間緊密相連，彼此互相銜接，呈現(xiàn)“鋪路石”狀。4. PCR產(chǎn)物半定量分析

一.白念珠菌與 KB 細(xì)胞的黏附（一）白念珠菌黏附 KB 細(xì)胞的顯微鏡下觀察正常的 KB 細(xì)胞是扁平的多角形，在胞質(zhì)靠近中央處有圓形的細(xì)胞核，各個細(xì)胞間緊密相連，彼此互相銜接，呈現(xiàn)“鋪路石”狀。圖 1 正常貼壁生長的 KB 細(xì)胞 圖 2 孢子相白念珠菌黏附 KB 細(xì)胞（倒置顯微鏡 40×） （革蘭氏染色 100×）

【參考文獻】

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本文編號：2746697