發(fā)布時(shí)間：2020-07-08 03:48

【摘要】：口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔內(nèi)最常見的原發(fā)腫瘤。目前口腔癌的主要治療手段包括手術(shù)和放射治療,但傳統(tǒng)的治療方式存在不足,并且相當(dāng)大比例的口腔癌患者可能發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。為了提高口腔鱗狀細(xì)胞癌的治療效率,大量的研究關(guān)注于探索新的藥物治療靶點(diǎn)。自噬過程被認(rèn)為是其中可能的靶點(diǎn)之一。自噬(autophagy)是一種廣泛存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)降解途徑,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞器更新都有著重大的意義。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中,自噬活動(dòng)貫穿全程。自噬維持穩(wěn)態(tài),對(duì)抗壓力的屬性也使它同時(shí)具有抑制腫瘤和促進(jìn)腫瘤的雙重屬性。天然抗腫瘤的一些小分子化合物在化療藥物中占有重要地位。目前從天然藥物中尋找新的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)。丹參,為唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根莖。丹參酮ⅡA是從丹參中提取分離得到的二萜醌類化合物,被認(rèn)為是丹參的主要有效成分。繼往文獻(xiàn)報(bào)道丹參酮ⅡA具有廣譜抗腫瘤活性,還能通過誘導(dǎo)自噬使口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)放射治療敏化。據(jù)此我們推測(cè)丹參酮ⅡA可能通過調(diào)控自噬對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞同樣具有抗腫瘤作用。在本研究中,我們主要關(guān)注丹參酮ⅡA是否對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞具有抑制作用,丹參酮ⅡA能否誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞自噬,丹參酮ⅡA誘導(dǎo)鱗癌自噬的分子機(jī)制是什么以及丹參酮ⅡA對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的抑制作用和自噬的關(guān)系,以此探討丹參酮ⅡA對(duì)口腔鱗癌潛在的治療價(jià)值以及自噬過程在口腔鱗癌的治療中可能發(fā)揮的作用。本課題采用人口腔鱗癌細(xì)胞系SCC-9和敲低beclin1表達(dá)的SCC-9細(xì)胞系用于體外實(shí)驗(yàn),OSCC荷瘤裸鼠模型用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。用不同濃度的丹參酮ⅡA處理SCC-9細(xì)胞后,通過CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖的抑制作用,流式細(xì)胞儀檢測(cè)SCC-9細(xì)胞的凋亡水平,透射電子顯微鏡檢測(cè)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SCC-9細(xì)胞的自噬水平,并通過western blotting實(shí)驗(yàn)測(cè)定BECLIN1,ATG7,ATG12-ATG5,PI3K,AKT,mTOR C1等蛋白的表達(dá)水平。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,用將細(xì)胞分為A空白組:加入新鮮培養(yǎng)液;B TAN組:調(diào)節(jié)培養(yǎng)液丹參酮ⅡA濃度為18μM;C siBECLIN1組:使用敲低beclin1基因表達(dá)的SCC-9細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),余同空白組;D TAN+siBECLIN1組:使用敲低beclin1基因表達(dá)的SCC-9細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),調(diào)節(jié)培養(yǎng)液丹參酮ⅡA濃度為18μM;E CQ組:培養(yǎng)液中加入自噬抑制劑氯喹。檢測(cè)各組細(xì)胞的凋亡水平,自噬水平及自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,雄性BALB/c-nu小鼠被隨機(jī)分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,空白組:裸鼠皮下注射SCC-9細(xì)胞荷瘤;TAN組:裸鼠皮下注射SCC-9細(xì)胞后,注射區(qū)域局部注射丹參酮ⅡA;si BECLIN1+TAN:采用敲低beclin1基因表達(dá)的SCC-9細(xì)胞,配合TAN組的成瘤操作方法進(jìn)行荷瘤;小鼠四周后麻醉處死,通過定期記錄瘤體體積描繪腫瘤生長(zhǎng)曲線;通過HE染色觀察腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu);通過免疫組化染色和western blotting檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了丹參酮ⅡA對(duì)SCC-9細(xì)胞增殖的抑制作用,丹參酮ⅡA誘導(dǎo)SCC-9細(xì)胞發(fā)生caspase-3依賴的凋亡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA通過對(duì)BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5的誘導(dǎo)作用和對(duì)PI3K/AKT/mTOR的抑制作用共同促進(jìn)了SCC-9細(xì)胞自噬。丹參酮ⅡA對(duì)SCC-9細(xì)胞的自噬誘導(dǎo)作用主要依賴于BECLIN1的活性,自噬促進(jìn)丹參酮ⅡA抑瘤作用。OSCC荷瘤裸鼠模型上的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果。給予丹參酮ⅡA可抑制BALB/c-nu小鼠SCC-9腫瘤的生長(zhǎng)速度,敲低BECLIN1的SCC-9腫瘤可以抵抗丹參酮ⅡA的抑瘤作用;給予丹參酮ⅡA可以誘導(dǎo)SCC-9腫瘤發(fā)生自噬;同樣處理?xiàng)l件下敲低BECLIN1的SCC-9腫瘤自噬水平較SCC-9腫瘤降低。根據(jù)結(jié)果我們推斷丹參酮ⅡA對(duì)OSCC細(xì)胞的抑制作用基于部分依賴于BECLIN1的作用機(jī)制:beclin1基因的敲低阻斷了丹參酮ⅡA在體內(nèi)和體外對(duì)SCC-9細(xì)胞的作用。本研究初步解釋了丹參酮ⅡA的作用機(jī)理:通過誘導(dǎo)BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5通路和抑制PI3K/AKT/mTOR通路共同誘導(dǎo)OSCC的細(xì)胞自噬,從而抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。本研究證實(shí)了丹參酮ⅡA對(duì)OSCC細(xì)胞的抗腫瘤作用,提示對(duì)自噬的調(diào)控有可能成為治療OSCC的新的靶點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.8
【圖文】：

圖 1.3.1 不同濃度丹參酮 IIA 對(duì) SCC-9 細(xì)胞增殖的抑制作用同濃度丹參酮 IIA 不同作用時(shí)間對(duì)人鱗癌細(xì)胞系 SCC-9 增殖的抑 SCC-9 細(xì)胞中加入丹參酮 IIA 藥液培養(yǎng)后，SCC-9 細(xì)胞受到明顯存在明顯劑量依賴，藥物處理各組相比對(duì)照組均有顯著差異，2 倍 0.5 倍 IC50 組有顯著差異。同時(shí)隨著時(shí)間推移，丹參酮 IIA 的抑 1.3.2）。

圖 1.3.1 不同濃度丹參酮 IIA 對(duì) SCC-9 細(xì)胞增殖的抑制作用度丹參酮 IIA 不同作用時(shí)間對(duì)人鱗癌細(xì)胞系 SCC-9 增9 細(xì)胞中加入丹參酮 IIA 藥液培養(yǎng)后，SCC-9 細(xì)胞受顯劑量依賴，藥物處理各組相比對(duì)照組均有顯著差異 IC50 組有顯著差異。同時(shí)隨著時(shí)間推移，丹參酮 II2）。

圖 1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)不同濃度丹參酮 IIA 誘導(dǎo) SCC-9 細(xì)胞凋亡的能力組；B 0.5 倍 IC50 組；C 1 倍 IC50 組；D 2 倍 IC50 組；E 不同濃度丹參酮 IIA 誘細(xì)胞的凋亡率，*：與空白組有顯著差異，p < 0.05；**：與 0.5 倍 IC50 組有顯著差0.05.1.3.4 Western blotting 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平隨著丹參酮 IIA 濃度的增加，caspase-3 的表達(dá)水平升高，提示凋亡水高。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 溫玉明,代曉明,王昌美,李龍江,付風(fēng)華,王曉毅,唐休發(fā),劉華,華成舸,潘劍;口腔頜面部惡性腫瘤6539例臨床病理分析[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2001年05期

本文編號(hào)：2746053