【摘要】：口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)的侵襲性強(qiáng),死亡率較高。雖然OSCC的診治已取得很突出的成績,但是中晚期患者生存質(zhì)量仍然很差。為了擴(kuò)展OSCC的治療手段和提高OSCC患者的生存期,探索OSCC發(fā)病的分子機(jī)制、尋找診斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)的研究是目前亟待解決的課題。近些年,基因組微陣列以及全基因組測序技術(shù)的進(jìn)步,提供了基因的基因組學(xué)證據(jù),利于從整體的角度全面研究基因。研究者發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在機(jī)體生長、發(fā)育及病理方面發(fā)揮了重要作用,尤其是長鏈非編碼RN A(long non-coding RNA,LncRNA)調(diào)控著惡性腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā),甚至參與了腫瘤的耐藥。因此,有必要深入探討lncRNA在OSCC發(fā)病過程中的作用機(jī)制。為此,我們應(yīng)用lncRNA表達(dá)譜芯片對(duì)OSCC和對(duì)應(yīng)正常組織樣本中的lncRNA進(jìn)行篩選,以期發(fā)現(xiàn)OSCC中差異表達(dá)的lncRNA;根據(jù)構(gòu)建差異表達(dá)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),發(fā)掘OSCC發(fā)病過程中節(jié)點(diǎn)lncRNA,分析其與OSCC臨床病理資料的關(guān)系;選取共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA進(jìn)行細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn),觀察其對(duì)OSCC細(xì)胞的增殖、侵襲、凋亡等生物學(xué)行為的影響,并初步研究其可能機(jī)制。本次研究將有助于揭示OSCC的發(fā)病機(jī)制,同時(shí)也為OSCC的診斷、預(yù)后的生物標(biāo)志物及靶向治療藥物的尋找與開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。第一部分 人口腔鱗狀細(xì)胞癌lncRNA差異表達(dá)譜的篩選及驗(yàn)證目的:為探討口腔鱗癌中l(wèi)ncRNA的表達(dá)情況,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用lncRNA表達(dá)譜芯片檢測口腔鱗癌中的lncRNA表達(dá)譜,明確lncRNAs和mRNAs在口腔鱗癌與正常組織中的表達(dá)是否存在差異。方法:提取3例口腔鱗癌患者的腫瘤組織和正常組織中的RNA,應(yīng)用lnc RNA表達(dá)譜芯片構(gòu)建口腔鱗癌中l(wèi)nc RNA及m RNA差異表達(dá)譜,建立差異表達(dá)的lnc RNAs及m RNAs共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。通過GO分析及KEGG富集分析,預(yù)測差異表達(dá)lnc RNAs的生物學(xué)功能。利用cis和trans調(diào)控,預(yù)測差異表達(dá)lnc RNAs的靶基因。選取部分差異表達(dá)的lnc RNAs,應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果:1.芯片篩選出2294條差異表達(dá)lnc RNAs(上調(diào)lnc RNAs為933條,下調(diào)lnc RNAs為1361條);1938條差異表達(dá)m RNAs(上調(diào)m RNAs為891條,下調(diào)m RNAs為1047條)。2.GO分析顯示,差異表達(dá)基因分別在分子功能(MF)、生物過程(BP)和細(xì)胞成分(CC)中富集。其中,富集度排名前三位的是interleukin-1binding(GO:0019966;Ontology:molecular function;P=0.0003)、response to interferon-alpha(GO:0035455;Ontology:biological process;P=1.37E-10)、establishment of epithelial cell apical/basal polarity(GO:0045198;Ontology:biological process;P=0.0003)。KEGG通路分析顯示,差異表達(dá)的m RNAs主要富集在38個(gè)生物學(xué)通路中。其中,很多通路與癌癥相關(guān),如“pathways in cancer”(富含36個(gè)差異表達(dá)基因),“bladder cancer”(富含8個(gè)差異表達(dá)基因),“metabolic pathways”(富含109個(gè)差異表達(dá)基因)、“pancreatic cancer”(富含11個(gè)差異表達(dá)基因)和“PPAR signaling pathway”(富含11個(gè)差異表達(dá)基因)。3.靶基因預(yù)測結(jié)果表明,1470個(gè)差異表達(dá)的lnc RNAs具有cis或trans調(diào)控靶基因。其中,1356個(gè)lnc RNAs作用于1250個(gè)cis靶基因,370個(gè)lnc RNAs作用于2454個(gè)trans靶基因,256個(gè)lnc RNAs既作用于cis靶基因又作用于trans靶基因。4.通過構(gòu)建差異表達(dá)lnc RNAs和m RNAs的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)306個(gè)lnc RNAs與其他m RNAs和lnc RNAs發(fā)生著相互作用,其中TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1為發(fā)生相互作用最多的基因,是整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)基因。5.選取10個(gè)差異表達(dá)的lnc RNAs,在72例口腔鱗癌及正常組織中進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示,在口腔鱗癌中l(wèi)nc-MANSC4-8:1、CXCR2P1、NRIR、lnc-CMPK2-1:3和lnc-GLI3-4:1顯著上調(diào),而TMPRSS11BNL、MEG3、lnc-WRN-10:1、DANCR和lnc-TPP2-7:2顯著下調(diào),說明驗(yàn)證結(jié)果和芯片結(jié)果一致。小結(jié):1.實(shí)驗(yàn)篩選出2294條差異表達(dá)lnc RNAs和1938條差異表達(dá)m RNAs,下調(diào)表達(dá)基因多于上調(diào)表達(dá)基因。2.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1是共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)基因。3.qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果相一致,說明芯片結(jié)果可靠。第二部分 人口腔鱗狀細(xì)胞癌中長鏈非編碼RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1的表達(dá)及意義目的:研究lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鱗癌和正常組織中的差異表達(dá),分析其表達(dá)水平與口腔鱗癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法:收集2015年01月-2016年10月在河北醫(yī)大四院手術(shù)切除的72例患者的口腔鱗癌及對(duì)應(yīng)正常組織,采用qRT-PCR方法檢測lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1的表達(dá)水平,分析其表達(dá)水平與臨床病理特征及患者預(yù)后之間的關(guān)系。采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn),生存分析采用Kaplan-Meier方法并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鱗癌中低表達(dá)。2.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1表達(dá)水平與口腔鱗癌患者的年齡、性別、吸煙、腫瘤位置無關(guān),與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)有關(guān)。3.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1低表達(dá)的口腔鱗癌患者有著較短的無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間。小結(jié):Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1在口腔鱗癌組織中低表達(dá),并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)有關(guān)。Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1低表達(dá)的口腔鱗癌患者有著較短的無進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間。第三部分 長鏈非編碼RNA MEG3對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞生物學(xué)功能的影響目的:探討lnc RNA MEG3對(duì)口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。方法:利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)使lnc RNA MEG3在口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞中過表達(dá),通過MTT、Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞技術(shù)測定口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、凋亡的變化。借助Western blot和qRT-PCR觀察lnc RNA MEG3過表達(dá)對(duì)p53蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果:1.Lnc RNA MEG3在口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞中低表達(dá)。2.Lnc RNA MEG3過表達(dá),可以顯著抑制口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,并促進(jìn)p53蛋白的表達(dá)。小結(jié):Lnc RNA MEG3在口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞中過表達(dá),可以顯著抑制口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的生物學(xué)行為。結(jié)論:1.芯片篩選出2294條差異表達(dá)lnc RNAs和1938條差異表達(dá)m RNAs。下調(diào)表達(dá)基因多于上調(diào)表達(dá)基因,說明下調(diào)表達(dá)基因可能在口腔鱗癌發(fā)病過程中發(fā)揮更為重要作用。2.qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片結(jié)果相一致,提示芯片結(jié)果可靠。3.Lnc RNA TMPRSS11BNL、lnc-WRN-10:1可能是口腔鱗癌發(fā)病過程中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因,并與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和生存狀態(tài)密切相關(guān)。4.Lnc RNA MEG3發(fā)揮著抑癌基因的作用,可以顯著抑制口腔鱗癌Tca8113細(xì)胞的生物學(xué)活性。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R739.8
【圖文】：

1 Total RNA1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（1，2，3-正常組織；4，5，6-腔鱗癌組織）ig.1 Results of total RNA1% agarose gel electrophoresis (1，2，3-Norma4，5，6-OSCC) LncRNA 芯片實(shí)驗(yàn)結(jié)果.1 LncRNA 芯片雜交掃描結(jié)果利用 Agilent Microarray Scanner 掃描雜交后的芯片，結(jié)果顯示芯片信號(hào)分布均勻，強(qiáng)度較高，并且清晰，沒有邊緣化效應(yīng)等情況�？瞻c(diǎn)無信號(hào)，陽性對(duì)照點(diǎn)和陰性對(duì)照點(diǎn)相應(yīng)有強(qiáng)、弱信號(hào)，結(jié)果對(duì)比明見圖 2）。

1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（1，2，3-正常組腔鱗癌組織） total RNA1% agarose gel electrophoresis (14，5，6-OSCC)實(shí)驗(yàn)結(jié)果片雜交掃描結(jié)果nt Microarray Scanner 掃描雜交后的芯片，，強(qiáng)度較高，并且清晰，沒有邊緣化效應(yīng)性對(duì)照點(diǎn)和陰性對(duì)照點(diǎn)相應(yīng)有強(qiáng)、弱信號(hào)

圖 3 熒光密度值分布箱線圖Fig.3 Box-whisker plot of fluorescent density value火山圖（Volcano plot）和分層聚類分析（Hierarchical）圖中的 X 軸和 Y 軸分別表示差異倍數(shù)和 P 值，經(jīng)歸一的信號(hào)值分布在對(duì)應(yīng)區(qū)域，灰點(diǎn)表示檢測到的基因不符篩選標(biāo)準(zhǔn)。火山圖結(jié)果說明存在很多顯著差異表達(dá)的As。所謂的分層聚類分析，就是指根據(jù)不同樣品間基因As)表達(dá)水平差別，把表達(dá)水平相近樣品逐步分類聚集，似樣品更容易聚類在一起，更直觀呈現(xiàn)出樣本間的關(guān)系個(gè)基因，每列表示一個(gè)樣本。由圖可以看出兩組間的表圖 4）。

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本文編號(hào)：2744461