【摘要】： 組織工程學的發(fā)展為組織缺損的修復以及器官的重建再造開辟了一條嶄新的道路,構建組織工程化組織的研究是目前口腔頜面整形領域關注的熱點之一。由于牙齒對于頜面骨的生長發(fā)育,對于維持頜面部的美觀,對于語言、咀嚼功能有著重要的作用,許多國家試圖利用組織工程學技術構建組織工程化牙齒。牙本質是構成牙齒的主體,在組織工程化牙齒的形成過程中牙本質的構建是一個關鍵。本研究對構建組織工程化牙本質的種子細胞、生物支架材料、組織工程化牙本質構建等方面進行了探討。 目的:利用基因轉染技術對來源廣泛易于獲得和培養(yǎng)的口腔粘膜成纖維細胞進行牙本質基質蛋白1(dentin matrix protein1, DMP1)基因轉染,獲得牙本質基質蛋白1基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞(dentin matrix protein1-porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF),通過對牙本質基質蛋白1基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞生物學性能、成牙本質細胞特異性基因蛋白表達的觀察,探討構建組織工程化牙本質的種子細胞。 利用建立的組織工程化牙本質種子細胞(牙本質基質蛋白1基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞,DMP1-POMF)復合脫細胞真皮基質進行培養(yǎng),通過HE染色光鏡觀察、掃描電鏡觀察、流式細胞檢測探討DMP1-POMF種子細胞與脫細胞真皮基質的相容性,評價脫細胞真皮基質作為構建組織工程化牙本質支架材料的可行性;通過裸鼠肌肉內植入DMP1-POMF復合脫細胞真皮基質支架材料,觀察其在動物體內的生長、組織學結構的變化、牙本質特異性基因蛋白的表達,探討組織工程化牙本質的構建。 對建立的組織工程化牙本質種子細胞(牙本質基質蛋白1基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞,DMP1-POMF)進行細胞團三維立體培養(yǎng),通過細胞形態(tài)學觀察、蛋白表達定量分析,評價細胞團內DMP1-POMF細胞的生物學特性和成牙本質細胞特異性基因蛋白的表達;通過DMP1-POMF細胞團體內蓋髓的組織學及免疫組織化學檢測,評價組織工程化牙本質種子細胞(牙本質基質蛋白1基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞,DMP1-POMF)細胞團三維立體培養(yǎng)在修復牙本質缺損中的作用。 方法: 1 pEGFP-DMP1基因真核表達質粒的構建。參照2006年3月Kim J等發(fā)表的豬DMP1全基因序列,委托上海捷瑞生物工程有限公司合成并構建了重組綠色熒光融合蛋白pEGFP-DMP1質粒。 重組質粒經擴增提取后用XhoI和EcoRI雙酶切,產物進行瓊脂糖凝膠電泳。確定后對全基因序列進行測序檢測。 2細胞培養(yǎng)及牙本質基質蛋白1(DMP1)基因轉染 2.1豬口腔粘膜成纖維細胞的原代培養(yǎng)及來源鑒定 中國農業(yè)大學實驗動物研究所購買10月齡中國實驗小型豬,3%戊巴比妥鈉耳后肌肉麻醉,無菌條件下留取頰粘膜固有層結締組織標本,置含抗生素預冷DMEM培養(yǎng)液中,剪成約1mm3的小塊,在含10% FBS的DMEM,37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)豬口腔粘膜成纖維細胞(porcine oral mucosa fibroblasts, POMF)。 免疫組化ABC法進行波形絲蛋白和細胞角蛋白抗體染色,作細胞來源鑒定。第四代細胞用于基因轉染。 2.2骨髓間質干細胞(mesenchymal stem cells, MSC)體外分離與培養(yǎng) 實驗豬經麻醉后,用16號穿刺針于股骨大轉子處穿刺,抽取骨髓4ml,置于肝素化的25ml無菌培養(yǎng)液中,1000r/min離心10min,棄上清,在含10%FBS的DMEM,37℃5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。5天后全量換液,以后每周2次換液。第三代細胞用于基因轉染,作為口腔粘膜成纖維細胞(POMF)的對照組。 2.3 DMP1基因轉染及篩選 轉染前用含10%FBS的DMEM調整細胞濃度至1×105接種于6孔板中,CO2孵箱培養(yǎng)至60%匯合。將細胞分為三組: A組:為牙本質基質蛋白1基因轉染豬口腔粘膜成纖維細胞組,對口腔粘膜成纖維細胞進行牙本質基質蛋白1基因轉染,本研究將其命名為牙本質基質蛋白1基因轉染的豬口腔粘膜成纖維細胞(dentin matrix protein1- porcine oral mucosa fibroblasts, DMP1-POMF)。 B組:為載體基因轉染口腔粘膜成纖維細胞組,對口腔粘膜成纖維細胞轉染空載體pEGFP-C1基因,本研究將其命名為載體基因轉染的口腔粘膜成纖維細胞(pEGFP-C1-porcine oral mucosa fibroblasts,C1-POMF)。 C組:為牙本質基質蛋白1基因轉染骨髓間質干細胞組,對骨髓間質干細胞進行牙本質基質蛋白1基因轉染,本研究將其命名為牙本質基質蛋白1基因轉染的骨髓間質干細胞(dentin matrix protein1- mesenchymal stem cells,DMP1-MSC)。 細胞轉染48h后,按1

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