【摘要】： 成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma, AM)是口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤,占牙源性腫瘤的59.3%。AM雖為良性腫瘤,但具有局部侵襲性,腫瘤細(xì)胞常向骨小梁間侵潤,臨床治療容易復(fù)發(fā),其復(fù)發(fā)率高。反復(fù)多次手術(shù)給患者造成嚴(yán)重的面部畸形,并有可能惡變,因而研究其侵襲機制具有重要的意義。 到目前為止,成釉細(xì)胞瘤局部侵襲的機制尚未明了。一般認(rèn)為,腫瘤侵襲主要是指腫瘤細(xì)胞侵犯和破壞周圍正常組織的過程。腫瘤細(xì)胞的周邊為結(jié)締組織,即基底膜和細(xì)胞外基質(zhì),這些結(jié)構(gòu)的降解與破壞是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移多階段過程中的重要步驟。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要組織結(jié)構(gòu)為膠原、層粘素和纖維結(jié)合素等,這些結(jié)構(gòu)的破壞與降解需要相應(yīng)的溶解酶參與。研究表明,基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)和相應(yīng)的金屬酶組織抑制劑在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)任了重要的角色。其中,基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是目前研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲關(guān)系最為密切的一種基質(zhì)金屬蛋白酶。 已有的研究表明,MMP的調(diào)節(jié)具有三個水平,即基因轉(zhuǎn)錄水平、酶原的活化激活水平、抑制劑水平。現(xiàn)有的研究主要集中在后2個方面,而在MMP基因轉(zhuǎn)錄水平對MMP進行調(diào)節(jié)的研究很少。近年來,出現(xiàn)了一種新的基因研究手段-RNA干擾(RNA interference, RNAi),它是將與mRNA對應(yīng)的正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞,使mRNA發(fā)生特異性的降解,導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默。RNAi在研究基因功能、基因敲除、基因表達調(diào)控和基因治療方面發(fā)揮著重要作用。 本研究旨在以MMP-2為靶基因,采用RNA干擾的方法沉默MMP-2基因,從而從MMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MMP-2的表達,探討MMP-2基因沉默后AM細(xì)胞侵襲性生 物學(xué)行為的改變,進一步研究MMP-2與AM局部侵襲的關(guān)系。本研究分四部分,現(xiàn)摘要如下: 第一部分成釉細(xì)胞瘤原代細(xì)胞培養(yǎng)及生長特性 迄今為止,AM侵襲性生長的機制尚未完全明確。為了研究其侵襲機制,采用體外培養(yǎng)的AM細(xì)胞進行研究是一種重要的方法。由于AM細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基中生長緩慢,存活時間短,不容易純化,不利于AM的細(xì)胞生物學(xué)研究。為了探索更為適合AM細(xì)胞生長的培養(yǎng)基,本實驗擬采用DK-SFM無血清培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AM細(xì)胞,研究AM細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的生長特性,為進一步研究AM的細(xì)胞生物學(xué)行為奠定基礎(chǔ)。 方法:采用DK-SFM無血清培養(yǎng)基和DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)AM細(xì)胞,CK14、CK16、CK18及Vimentin免疫組織化學(xué)染色鑒定細(xì)胞來源,觀察細(xì)胞的生長特性、細(xì)胞形態(tài)和傳代次數(shù),流式細(xì)胞儀測定S期細(xì)胞比率(SPF)和增殖指數(shù)(PI)。結(jié)果:體外培養(yǎng)的AM細(xì)胞CK14、CK16免疫組化染色陽性,CK18及Vimentin免疫組化染色陰性。在DK-SFM培養(yǎng)基中,細(xì)胞形態(tài)清晰,僅見少許散在的成纖維細(xì)胞;細(xì)胞傳代3-6次,平均傳代4.8代;細(xì)胞存活48-97d,平均存活73.8 d; SPF平均值為6.8%,PI平均值為15.9%。在DMEM中,細(xì)胞形態(tài)不清晰,可見較多的成纖維細(xì)胞;細(xì)胞傳代2-4次,平均傳代3.2代;細(xì)胞存活27-61 d,平均存活46.7 d;SPF平均值為5.4%,PI平均值為11.0%。結(jié)論:在DK-SFM中培養(yǎng)的AM細(xì)胞存活時間長,傳代次數(shù)較多,DK-SFM較DMEM更適合AM細(xì)胞的體外培養(yǎng)。 第二部分MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)粒的構(gòu)建及序列優(yōu)化 RNA干擾是生物進化過程中抵抗病毒和轉(zhuǎn)座子的一種保守防御反應(yīng)。它是由正義RNA和反義RNA組成的雙鏈RNA在細(xì)胞內(nèi)被Dicer酶切割成約19~22nt的siRNA,進而形成siRNA蛋白復(fù)合物(siRNP),siRNP通過識別、降解具有同源序列的mRNA,最終導(dǎo)致特異性的基因表達沉默,屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制。當(dāng)進行RNA干擾實驗研究時,需要制備siRNA,目前,siRNA的制備的方法有體外制備法和體內(nèi)表達法兩種。前者是在體外合成siRNA,再導(dǎo)入siRNA于細(xì)胞內(nèi),該法存在基因沉默維持時間短、轉(zhuǎn)染效果不穩(wěn)定等問題。后者是在體外構(gòu)建siRNA表達載體,如質(zhì)粒載體或病毒載體,載體導(dǎo)入體內(nèi)后自動合成siRNA,引發(fā)基因沉默,該法的基因沉默時間長、轉(zhuǎn)染效果穩(wěn)定。因此,本實驗將構(gòu)建MMP-2特異性siRNA表達質(zhì)粒,并優(yōu)化特異性序列,為MMP-2基因相關(guān)的后續(xù)實驗研究奠定基礎(chǔ)。 方法:采用定向克隆的方法構(gòu)建P1、P2共2條MMP-2特異性siRNA表達質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,采用熒光顯微鏡觀察其轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR檢測MMP-2 mRNA的表達情況。結(jié)果:構(gòu)建的2條MMP-2特異性siRNA表達質(zhì)粒經(jīng)基因測序顯示克隆的序列完全正確,2條siRNA表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,轉(zhuǎn)染效率隨著時間的延長而增加,72h時,P1的轉(zhuǎn)染效率為41.8%, P2的轉(zhuǎn)染效率為93.2%,P2的轉(zhuǎn)染效率大于P1的轉(zhuǎn)染效率,差異具有顯著性,P0.05;72h時,P1、P2對MMP-2 mRNA的沉默效率分別為38.6%、68.9%。結(jié)論:體外構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并有效沉默MMP-2基因,但有序列差異性,P2的轉(zhuǎn)染效率和基因沉默效率優(yōu)于P1。 第三部分MMP-2靶向siRNA對成釉細(xì)胞瘤侵襲性的抑制作用 MMP-2的表達與活性調(diào)節(jié)一般有三個水平,即基因轉(zhuǎn)錄水平、酶原的活化激活、抑制劑水平。在本課題組的前期研究中,應(yīng)用MMP-2特異性抑制劑Ro31-9790明顯抑制了MMP-2的活性,使裸鼠腎包膜下的AM移植瘤的生長被抑制,這種對MMP-2的調(diào)節(jié)是在抑制劑水平上的調(diào)節(jié)。本實驗擬以第二部分構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞,以沉默MMP-2基因的表達。從而從MMP-2基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控MMP-2的表達,探討MMP-2基因沉默后AM細(xì)胞侵襲性生物學(xué)行為的改變,進一步研究AM局部侵襲性生長的機制。 方法:采用第一部分的無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)AM細(xì)胞,將體外構(gòu)建的MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞,熒光顯微鏡檢測siRNA表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效果,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況,明膠酶譜分析法檢測培養(yǎng)上清液中MMP-2的活性, RT-PCR檢測MMP-2 mRNA表達的改變,Western blotting印跡法檢測AM細(xì)胞MMP-2蛋白表達,三維培養(yǎng)檢測AM細(xì)胞的侵襲性,Transwell微侵襲分析檢測細(xì)胞的侵襲抑制率,細(xì)胞黏附分析法檢測細(xì)胞在Fn基質(zhì)上的黏附率。采用SPSS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果:siRNA表達質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞,實驗組細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期無明顯改變;96h時,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率為63.6%,培養(yǎng)上清液中酶原性MMP-2和活性MMP-2的表達分別下降了39.6%和56.5%;轉(zhuǎn)染96h后,AM細(xì)胞的MMP-2 mRNA表達水平下降了66.0%,MMP-2蛋白表達下降64.6%,細(xì)胞的侵襲抑制率為61.3%,黏附抑制率為48.3%,P0.05。結(jié)論:MMP-2靶向siRNA成功轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞并沉默MMP-2基因,抑制了MMP-2基因的表達,AM的侵襲性被明顯抑制,MMP-2與AM細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。 第四部分MMP-2靶向siRNA對成釉細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤的抑制作用 通過前面的實驗研究,我們已經(jīng)證明MMP-2靶向siRNA可以在體外沉默MMP-2基因從而抑制MMP-2基因的表達,進而抑制了AM細(xì)胞的侵襲性。為了進一步探討RNA干擾在生物體內(nèi)的效應(yīng),本實驗旨在構(gòu)建AM移植瘤模型,通過在移植瘤周圍局部注射MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)粒,探討體內(nèi)RNA干擾對AM侵襲性的抑制作用。方法:取新鮮的AM組織標(biāo)本,剪切成1-2mm3組織小塊,接種于裸鼠雙側(cè)前肢根部背側(cè)和后背部皮下。設(shè)立自身對照,即左側(cè)前肢處的移植瘤為空白組,注射250μl Opti-MEMR培養(yǎng)基;后背部的移植瘤為脂質(zhì)體組,在移植瘤周圍注射脂質(zhì)體混合物,空白組和脂質(zhì)體組均為對照組,右側(cè)前肢處的移植瘤為siRNA組,在移植瘤周圍注射MMP-2靶向siRNA表達質(zhì)�；旌衔�;接種后第2周末開始施加處理因素,記錄移植瘤體積和實驗終止時的瘤重,采用SPSS統(tǒng)計軟件包中的t檢驗法對數(shù)據(jù)進行檢驗,P0.05表示有顯著性差異。RT-PCR檢測移植瘤中MMP-2 mRNA的表達,Western blotting檢測移植瘤中MMP-2蛋白的表達,并對移植瘤進行組織病理學(xué)分析。結(jié)果:所有移植瘤均成活,實驗組移植瘤體積增加量少于對照組移植瘤體積的增加量,實驗組移植瘤的瘤重少于對照組移植瘤的瘤重,差異有顯著性,P0.05。對照組移植瘤周邊的疏松結(jié)締組織中都出現(xiàn)了AM濾泡樣結(jié)構(gòu),濾泡樣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)典型的V-G三聯(lián)征,實驗組移植瘤周邊的疏松結(jié)締組織中沒有AM濾泡樣結(jié)構(gòu)或僅僅殘留濾泡樣結(jié)構(gòu)的痕跡。對照組MMP-2 mRNA和MMP-2蛋白的表達水平均顯著性地高于實驗組的表達;實驗組MMP-2 mRNA表達相對抑制率為42.35%;MMP-2蛋白抑制率為51%。結(jié)論:成功構(gòu)建AM裸鼠皮下移植瘤動物模型; AM移植瘤的侵襲和生長被抑制可能是由于MMP-2靶向siRNA對MMP-2基因的沉默作用引起的。
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號】：R739.8
【圖文】：

見圖1-3、1-4。圖1-3 多房型AM 圖1-4 近牙槽突處呈蜂房型改變圖1-1 濾泡型AM，HE 染色，100× 圖1-2 叢狀型AM，HE 染色，100×

見圖1-3、1-4。圖1-3 多房型AM 圖1-4 近牙槽突處呈蜂房型改變圖1-1 濾泡型AM，HE 染色，100× 圖1-2 叢狀型AM，HE 染色，100×

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

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本文編號：2738801