發(fā)布時(shí)間：2020-06-28 08:59

【摘要】：目的：本研究采用體外實(shí)驗(yàn)，建立細(xì)胞與鈦片復(fù)合培養(yǎng)的體外培養(yǎng)模型，將由兔全血所制備的富血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)作用于其自體骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)，通過(guò)對(duì)鈦片表面細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)，探討不同濃度的自體PRP在不同時(shí)間段對(duì)鈦片表面BMSCs增殖的影響以及血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）濃度的變化，進(jìn)一步揭示PRP的作用機(jī)制，為臨床根據(jù)生理和病理的需要，選擇合適濃度的PDGF和PRP以及合理的應(yīng)用時(shí)間提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①BMSCs的培養(yǎng)：應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法取兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行原代培養(yǎng)，具體方法如下：將2-3月齡新西蘭大白兔以戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉，在腿部脛骨平臺(tái)處以16~#骨髓穿刺針垂直骨面，旋轉(zhuǎn)進(jìn)入骨髓腔，抽取4-6ml骨髓接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞達(dá)到90％融合時(shí)予以傳代，用倒置顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)。②繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線：于1-10d每天將接種于24孔板的第3代BMSCs各取3孔，酶消法消化后顯微鏡下計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。③鈦片的處理：將實(shí)驗(yàn)用直徑10mm，厚度1mm已打磨光滑的圓形鈦片依次用丙酮、無(wú)水乙醇、75%乙醇及雙蒸水各超聲清洗20min，高溫高壓消毒30min，無(wú)菌保存?zhèn)溆�。④PRP的制備：采用二次離心法分離兔全血獲得PRP，儀器計(jì)數(shù)法比較全血與PRP中的血小板數(shù)目。具體步驟是，方法同上麻醉實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，從頸動(dòng)脈處抽取所有全血約120ml，第一次先以1100r/min速度水平離心機(jī)室溫離心10min，吸取全部上清及紅細(xì)胞液面下2-3mm，再以2200r/min的速度離心10min，棄2/3上清，所剩1/3液體即為PRP，以牛凝血酶激活后2小時(shí)內(nèi)加入到細(xì)胞培養(yǎng)系中。⑤PRP作用于BMSCs：將配制的含不同濃度PRP(0%、10％、20％、30％)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液作用于生長(zhǎng)良好的已在鈦片表面適應(yīng)性生長(zhǎng)24h的第4代BMSCs，每孔設(shè)3復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組。⑥成骨細(xì)胞鑒定：取第3代BMSCs用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)后，以堿性磷酸酶染色法及鈣結(jié)節(jié)染色法驗(yàn)證其成骨分化能力。⑦M(jìn)TT法檢測(cè)增殖：分別在第1、4、7、10d取各孔實(shí)驗(yàn)組，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，清洗后加入MTT試劑于鈦片上，37℃孵育4h，再加入二甲基亞砜，結(jié)晶均勻溶解后在酶標(biāo)儀上測(cè)各標(biāo)本的OD值。⑧ELISA法測(cè)PDGF-AB濃度：分別在第0、1、2、3、4d取各鈦片組細(xì)胞的上清液，根據(jù)兔ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各標(biāo)本中PDGF-AB的OD值，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上獲得PDGF-AB濃度。⑨熒光染色觀察鈦片表面細(xì)胞形態(tài)：在第4、7、10d取出各實(shí)驗(yàn)組鈦片，固定后以熒光染色劑F-actin對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行熒光染色，再以DAPI最后復(fù)染細(xì)胞核，正置熒光顯微鏡下觀察。 結(jié)果：①倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)：原代BMSCs呈短梭形，至12d左右可達(dá)到80％融合，此時(shí)細(xì)胞形態(tài)為均一的長(zhǎng)梭形，漩渦狀排列，傳代后的細(xì)胞形態(tài)比原代細(xì)胞更為均一，增殖迅速。根據(jù)生長(zhǎng)曲線圖可知，傳代培養(yǎng)潛伏期一般為2-3d，4-8d為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，9-10d增殖趨于穩(wěn)定，達(dá)到平臺(tái)期，細(xì)胞增殖趨于平緩。②成骨能力鑒定：經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶染色結(jié)果示細(xì)胞胞漿中出現(xiàn)紅棕色、棕褐色或咖啡色顆粒，鈣結(jié)節(jié)染色示結(jié)節(jié)處有橘紅色鈣鹽沉積，即為鈣化結(jié)節(jié)，均呈陽(yáng)性表達(dá)，表明所培養(yǎng)的BMSCs具備成骨分化能力，為成骨細(xì)胞。③PRP的檢測(cè)：采用二次離心法得到的PRP中血小板數(shù)目為864±37×109/ml，是全血201±26×109/ml的4.3倍。PRP經(jīng)激活后，析出的上清液經(jīng)兔ELISA試劑盒檢測(cè)PDGF-AB值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上能獲得值為95.537±5.112ng/ml，二次離心法制備的PRP中含有高濃度的生長(zhǎng)因子PDGF-AB。④MTT檢測(cè)增殖結(jié)果：20％PRP組第7d時(shí)OD值最高，在第4d20%＞30%＞10%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；第7-10d，20%＞10%＞30%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；0%對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)間無(wú)明顯變化。因此增殖作用與PRP存在時(shí)間和濃度效應(yīng)，20%為最佳作用濃度。⑤PDGF-AB濃度變化：PDGF-AB值總體趨勢(shì)逐漸下降，受自分泌及旁分泌影響稍有波動(dòng)，但前3d仍能維持較高濃度。第4天生長(zhǎng)因子大量衰減，即表明該因子的有效作用時(shí)間為前3天。⑥熒光染色結(jié)果示：細(xì)胞核呈藍(lán)色，圓形或橢圓形，細(xì)胞骨架呈綠色，形態(tài)不規(guī)則，多角形，可見(jiàn)突起，包繞在細(xì)胞核周圍，符合成骨細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)論：①本實(shí)驗(yàn)中各濃度(10％、20％、30％)PRP均能有效地促進(jìn)BMSCs的增殖，其中20％PRP為最佳濃度。②二次離心法制備的PRP中含有高濃度的生長(zhǎng)因子PDGF-AB，在PRP20％濃度時(shí)PDGF-AB所對(duì)應(yīng)值為18.66-24.30ng/ml，為該因子作用于成骨細(xì)胞的最佳濃度范圍。③PRP中生長(zhǎng)因子PDGF-AB半衰期較短，前3天為最佳作用時(shí)間。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R780.2

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