【摘要】：齲病是牙體硬組織的細(xì)菌感染性疾病,是最常見(jiàn)的口腔疾病,變形鏈球菌是其主要致病菌。氟化物作為目前使用最廣泛的防齲制劑,對(duì)致齲菌的作用為氟防齲的重要機(jī)制之一。近年來(lái),為提高并維持菌斑內(nèi)較高氟水平,局部應(yīng)用氟化物的濃度增加,間隔時(shí)間縮短,最可能的后果是耐氟菌株的產(chǎn)生。有報(bào)道國(guó)外學(xué)者從應(yīng)用高濃度氟化鈉凝膠防治猛性齲的患者口腔中分離出變形鏈球耐氟菌株；之后,又有學(xué)者從干燥癥病人口腔中分離出變形鏈球菌耐氟菌株,這提示某些特殊人群的口腔中存在變形鏈球菌耐氟菌株。變形鏈球菌耐氟菌株產(chǎn)酸能力和耐酸性增強(qiáng),致齲性較親代菌株增強(qiáng),并且耐氟菌株的基因組和蛋白質(zhì)組均發(fā)生改變,但具體基因和蛋白還不能確定。雖然在正常人口腔中尚未分離出變形鏈球菌耐氟菌株,但氟化物的持續(xù)作用,體外耐氟菌株的誘導(dǎo)成功,都提示正常人群中亦可能產(chǎn)生耐氟菌株。耐氟菌株的出現(xiàn),為氟化物防齲提出了新的問(wèn)題,受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的密切關(guān)注,因而研究其發(fā)生、發(fā)展因素,對(duì)臨床上合理應(yīng)用氟化物及尋找新的防齲藥物具有重要意義。 本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn),變形鏈球菌耐氟菌株的ffh、dgk和dltc等耐酸相關(guān)基因較親代菌株有不同程度的突變,但對(duì)耐酸相關(guān)基因編碼蛋白的研究還比較缺乏。已有研究表明,僅有約2%的疾病與基因序列有關(guān),而98%的疾病與蛋白表達(dá)密切相關(guān)。基因是遺傳信息的攜帶者,而執(zhí)行這些信息所蘊(yùn)藏的生物學(xué)功能的是蛋白質(zhì),基因的表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)是生理功能的執(zhí)行者,我們對(duì)蛋白質(zhì)的研究將直接闡明生命在生理或病理?xiàng)l件下的變化機(jī)制。發(fā)揮生理功能時(shí)蛋白質(zhì)的表現(xiàn)是多樣的、動(dòng)態(tài)的,并不象基因組那樣基本固定不變。同一細(xì)胞、同一組織、同一器官在不同的生理?xiàng)l件和不同的外界環(huán)境影響下,蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)并不完全相同；病理狀態(tài)下的細(xì)胞蛋白質(zhì)組與正常生理?xiàng)l件下的也有所不同,這就需要通過(guò)差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究。 差異蛋白質(zhì)組學(xué)是針對(duì)不同空間、不同時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的蛋白質(zhì)組的整體進(jìn)行比較,分析不同蛋白質(zhì)組之間蛋白質(zhì)在表達(dá)數(shù)量、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)上的差異,研究差異蛋白質(zhì)及其功能。由于蛋白質(zhì)自身具有的多樣性、可變性和構(gòu)象的復(fù)雜性等特點(diǎn),使得蛋白質(zhì)研究技術(shù)難度非常大,蛋白質(zhì)組學(xué)研究能否成功,相當(dāng)程度上取決于其技術(shù)水平的高低。差異蛋白質(zhì)組學(xué)并不要求鑒定“全部”蛋白,而主要是找出有意義的差異蛋白,所以在技術(shù)上相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)。 對(duì)蛋白質(zhì)在不同狀態(tài),不同環(huán)境,不同處理等情況下表達(dá)量的變化進(jìn)行檢測(cè),這就需要用到蛋白質(zhì)組學(xué)的定量技術(shù)。定量技術(shù)是整個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)的精華部分,這種定量通常不必檢測(cè)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的絕對(duì)含量,而只需對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行定量即可。定量蛋白質(zhì)組學(xué)是把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜的混合體系內(nèi)所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確定量和鑒定的一門(mén)學(xué)科,這標(biāo)志著蛋白質(zhì)組學(xué)研究已從對(duì)蛋白質(zhì)簡(jiǎn)單的定性向精確的定量方向發(fā)展。 蛋白質(zhì)組學(xué)研究中應(yīng)用的定量方法主要有兩種,一種是基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色基礎(chǔ)上的定量,另外一種是基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)的定量,包括標(biāo)記定量技術(shù)(Labeling quantitation)和非標(biāo)記定量技術(shù)(Label-free quantitation)兩種。基于傳統(tǒng)雙向凝膠電泳及染色基礎(chǔ)上的定量,此方法由于雙向凝膠電泳本身的限制,不能對(duì)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)絕對(duì)分離,不能有效檢測(cè)出具有極端等電點(diǎn)的、分子質(zhì)量太大和太小的蛋白質(zhì)以及低豐度的蛋白質(zhì)和膜蛋白,因而逐漸有被基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)代替的趨勢(shì)。 從原理上看,標(biāo)記定量技術(shù)的主要策略是對(duì)要比較的樣本的蛋白質(zhì)或者肽段分別進(jìn)行輕和重的穩(wěn)定同位素標(biāo)記,從而使他們的分子量具有一定的差異,酶解后的肽段同時(shí)進(jìn)行質(zhì)譜分析,根據(jù)質(zhì)譜上成對(duì)出現(xiàn)的輕重同位素峰的強(qiáng)度進(jìn)行相對(duì)定量。非標(biāo)記定量技術(shù),未對(duì)研究樣本進(jìn)行標(biāo)記,樣本酶解產(chǎn)物分別進(jìn)行質(zhì)譜分析,然后根據(jù)峰面積或者肽段總次數(shù)對(duì)肽段和蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。 非標(biāo)記定量技術(shù)(Label-free quantitation)不需要昂貴的同位素標(biāo)簽做內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)耗費(fèi)低；對(duì)樣本的操作也最少,從而使其最接近原始狀態(tài)；并且不受樣品條件的限制,克服了標(biāo)記定量技術(shù)在對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行定量方面的缺陷,因此它在定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中受到了眾多科學(xué)工作者的推崇,得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。目前,已經(jīng)有一系列配套的非標(biāo)記定量分析軟件,其中包括本研究采用的GE公司開(kāi)發(fā)的DeCyder MSTM,具有很好的定量準(zhǔn)確性和可信性。DeCyder MSTM軟件對(duì)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)非標(biāo)記定量分析是將質(zhì)譜數(shù)據(jù)由譜峰形式轉(zhuǎn)化為直觀的類(lèi)似雙向凝膠的圖譜,譜圖上每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)肽段,而不是蛋白質(zhì)；再比較不同樣本上相應(yīng)肽段的強(qiáng)度,從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量。 本研究通過(guò)基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù),利用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和GE公司開(kāi)發(fā)的DeCyder MSTM軟件分析聯(lián)用研究變形鏈球菌(UA159)耐氟菌株及其親代菌株的蛋白質(zhì)表達(dá)差異,發(fā)現(xiàn)并鑒定了明顯差異蛋白67種,蛋白表達(dá)上調(diào)的為24種,蛋白表達(dá)下調(diào)的有43種。這些明顯差異蛋白包括部分致齲毒力因子,其中與粘附有關(guān)的2種,為葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞表面粘附素PAC；與產(chǎn)酸相關(guān)的一種,為乳酸脫氫酶；與耐酸相關(guān)的4種,為F-ATP酶β-亞單位、信號(hào)識(shí)別顆粒蛋白質(zhì)亞單位Ffh、分子伴侶DnaK和伴侶蛋白GroEL。同時(shí)應(yīng)用GO (Gene Ontology)工具對(duì)差異蛋白進(jìn)行生物學(xué)過(guò)程、分子功能和細(xì)胞定位分析,并構(gòu)建了變形鏈球菌耐氟菌株和其親代菌株的差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。 本研究的創(chuàng)新性體現(xiàn)在,首次應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)變形鏈球菌(UA159)耐氟菌株及其親代菌株進(jìn)行差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究,利用GE公司開(kāi)發(fā)的DeCyder MSTM軟件,并結(jié)合NCBI鏈球菌蛋白數(shù)據(jù)庫(kù),發(fā)現(xiàn)并鑒定了明顯差異蛋白67種。同時(shí)構(gòu)建了變形鏈球菌耐氟菌株和其親代菌株的差異蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù),為以后進(jìn)一步研究變形鏈球菌和變形鏈球菌耐氟菌株致齲毒力因子相關(guān)基因及其編碼的蛋白的功能打下基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2727850