【摘要】：矯治性牙位移動過程中，牙槽骨的應(yīng)力改建過程主要是以破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成相互協(xié)調(diào)的結(jié)果。其中張應(yīng)力區(qū)中所發(fā)生的由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成是錯位牙矯治性定向移動中安全和穩(wěn)定的根本保證。人牙周膜干細(xì)胞(PDLSCs)是一群來源于人牙周膜組織，具有多項(xiàng)分化潛能的干細(xì)胞，被認(rèn)為是進(jìn)行牙周組織修復(fù)與再生的理想的種子細(xì)胞。已有研究認(rèn)為，PDLSCs是正畸牙移動過程中骨改建過程的關(guān)鍵細(xì)胞。力學(xué)刺激作用于該細(xì)胞，信號傳遞是通過胞外基質(zhì)傳導(dǎo)至胞漿引起一系列細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)變化，從而觸發(fā)牙槽骨的應(yīng)力改建，最終實(shí)現(xiàn)了牙齒的定向移動。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)：體外培養(yǎng)的PDLSCs中具有Hh信號通路的表達(dá)，并且該信號通路參與了PDLSCs的應(yīng)力成骨過程。 Hedgehog信號通路在哺乳動物多器官的正常發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，具有調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和凋亡的能力。研究證實(shí)，在胚胎發(fā)育軟骨內(nèi)成骨的過程中，Hedgehog信號通路通過細(xì)胞表面受體與配體PTCH或SMO競爭性結(jié)合而激活，從而誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化。同時研究表明，Hedgehog信號通路在牙胚發(fā)育過程中起關(guān)鍵性的作用，介導(dǎo)了牙胚發(fā)育早期上皮與間充質(zhì)之間、上皮與上皮之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。近年來研究提示，Hedgehog信號通路促進(jìn)了PDLSCs的增殖過程。根據(jù)已有研究，Hedgehog信號通路的激活會促進(jìn)MSCs的增殖并調(diào)控MSCs的成骨分化，同時適宜的力學(xué)刺激更能有效提高M(jìn)SCs的細(xì)胞活性并增強(qiáng)其功能。但是，在PDLSCs應(yīng)力成骨過程中Hedgehog信號通路的調(diào)控機(jī)制如何尚未得以證實(shí)。Smoothened(SMO)是Hh信號通路中的重要受體蛋白，負(fù)責(zé)Hh的信號傳導(dǎo)和靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活該信號通路。因此，本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒載體介導(dǎo)的RNA過表達(dá)及干擾技術(shù)調(diào)節(jié)PDLSCs中SMO的表達(dá)，研究分析SMO在應(yīng)力作用下對PDLSCs成骨分化的影響。為進(jìn)一步研究SMO基因的功能及靶向調(diào)控PDLSCs應(yīng)力作用下的成骨分化奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，以期待進(jìn)一步揭示矯治性牙位移動過程中牙槽骨應(yīng)力條件下的改建機(jī)制。 目的： 體外構(gòu)建及篩選人SMO基因的慢病毒過表達(dá)及干擾載體，使用此載體調(diào)節(jié)PDLSCs中SMO基因的表達(dá)并檢測其在應(yīng)力作用下對PDLSCs成骨分化的影響。 方法： 1、人牙周膜干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定： PDLSCs來源于臨床上12—24歲之間因正畸需要或阻生而拔除的牙體牙周均健康的新鮮牙齒，并經(jīng)知情同意。用含1%雙抗的PBS反復(fù)沖洗，冠根單向刮取牙根中1／3的牙周膜，采用酶消化組織塊法聯(lián)合培養(yǎng)，48h后首次換液，后每3d換液，細(xì)胞融合至80㳠時傳代，經(jīng)流式細(xì)胞分選獲得PDLSCs，經(jīng)鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及其克隆形成能力；免疫組化檢測其角蛋白及波形蛋白表達(dá)；流式細(xì)胞術(shù)分析其細(xì)胞表面標(biāo)志物STRO-1、CD146；成骨、成脂誘導(dǎo)分化試驗(yàn)等進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定。 2、慢病毒感染： PDLSCs分別被攜帶SMO特異性過表達(dá)、RNAi的慢病毒感染，通過real-time PCR、Western blot檢測PDLSCs中SMO基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)分四組，包括由攜帶SMO特異性過表達(dá)慢病毒感染的PDLSCs/SMO-過表達(dá)組、由攜帶SMO特異性RNAi慢病毒感染的PDLSCs/SMO-RNAi組、由空慢病毒感染的PDLSCs/vector組和正常細(xì)胞對照PDLSCs/wt組。 3、細(xì)胞應(yīng)力加載： .將第4—6代PDLSCs的四組細(xì)胞分別種于BioFlex專用加載六孔培養(yǎng)板(硅膠模制孔底)內(nèi)，通過國際標(biāo)準(zhǔn)化水平的加力裝置FX-4000T加載動態(tài)張應(yīng)力，加力方式為最大形變量12%，最小型變量為0的正弦波，頻率0.1Hz(5s拉伸5s放松)，加力時間為0h(只在BioFlex板中靜置培養(yǎng))、6h、12h、24h，加力完畢后收集細(xì)胞，通過Westernblot檢測PDLSCs相關(guān)成骨標(biāo)志物Runx2、ALP的表達(dá)變化，以及Hh信號通路相關(guān)效應(yīng)蛋白SMO、GLI1、PTCH1的表達(dá)變化。 結(jié)果： 1、原代培養(yǎng)的PDLCs增殖快，單個細(xì)胞有2-4個突起，長梭形或不規(guī)則形；通過流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞抗體STRO-1分選所得PDLSCs陽性率為41.7%，其與PDLCs形態(tài)相似，體積略小，成旋渦狀或放射狀排列，細(xì)胞具有克隆形成能力；免疫組化檢測顯示PDLSCs角蛋白表達(dá)陰性，波形蛋白表達(dá)陽性，說明所得PDLSCs來源于中胚層；流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示PDLSCs高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志STRO-1和CD146；經(jīng)成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后鏡下可見礦化結(jié)節(jié)形成，茜素紅染色陽性；成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后可見脂滴形成，油紅O染色陽性，說明PDLSCs具有成骨、成脂等多向分化能力。 2、定量PCR檢測轉(zhuǎn)染過表達(dá)病毒后PDLSCs中SMO基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染過表達(dá)病毒的PDLSCs中SMO基因轉(zhuǎn)錄水平增加明顯，達(dá)未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的15倍，從而成功在PDLSC細(xì)胞中獲得了SMO基因的外源性表達(dá) 3、western blot檢測結(jié)果顯示慢病毒干擾載體能夠在蛋白水平有效的下調(diào)目的蛋白SMO的表達(dá)，表達(dá)量降低80%(干擾組灰度值0.22±0.04vs對照組灰度值1.15±0.13，p0.01)。 4、通過FX-4000T應(yīng)力加載系統(tǒng)對四組PDLSCs進(jìn)行同一加載方式、不同時間段的應(yīng)力加載后檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)： (1) PDLSCs/wt組加力后，ALP、Runx2的表達(dá)水平較未加力時上調(diào)，說明應(yīng)力刺激能促進(jìn)PDLSCs的成骨分化。 (2) PDLSCs/wt組加力后，Hedgehog家族中的膜受體PTCH1、SMO、核心轉(zhuǎn)錄因子GLI1及成骨標(biāo)志物ALP、Runx2的表達(dá)均較未加力時升高，說明Hh信號對力學(xué)刺激敏感且參與了PDLSCs的成骨分化。 (3) PDLSC/SMO-RNAi組與PDLSCs/wt組比較，在加力早期(0-6h)PDLSC/SMO-RNAi組細(xì)胞ALP、Runx2的表達(dá)較PDLSCs/wt組低，但是隨著加力時間的延長(6-12h)，PDLSC/SMO-RNAi組細(xì)胞ALP、Runx2的表達(dá)仍有升高趨勢，這一結(jié)果提示，SMO基因與PDLSCs應(yīng)力成骨過程密切相關(guān)，同時Hh信號并非是應(yīng)力促進(jìn)PDLSCs成骨分化的唯一途徑，應(yīng)力刺激還可以通過其他通路或因子促進(jìn)PDLSCs的成骨分化。 (4) PDLSCs/wt組、PDLSC/SMO-過表達(dá)組、PDLSC/SMO-RNAi組應(yīng)力加載后，ALP、Runx2的表達(dá)量均在12h時升高最明顯，說明應(yīng)力刺激12h時具有較強(qiáng)的促成骨分化作用。 (5) PDLSCs/wt和PDLSC/SMO-過表達(dá)組在加力的早期(0-12h)ALP、Runx2的表達(dá)量逐漸增加,在加力晚期(12-24h)ALP、Runx2的表達(dá)量逐漸降低，這一趨勢也提示Hedgehog信號通路對成骨分化的作用：早期表現(xiàn)為促進(jìn)，而晚期表現(xiàn)為抑制。 (6)在不同的時間段，PDLSC/SMO-過表達(dá)組ALP、Runx2的表達(dá)均比PDLSCs/wt及PDLSC/SMO-RNAi組細(xì)胞顯著，說明SMO基因?qū)DLSCs成骨分化的促進(jìn)作用明顯。 結(jié)論： 1、從人牙周膜組織中分離培養(yǎng)并經(jīng)流式細(xì)胞儀分選得到的PDLSCs在體外具有一定的克隆形成能力，且細(xì)胞表面分子表達(dá)情況與文獻(xiàn)報(bào)道一致，并在誘導(dǎo)環(huán)境下表現(xiàn)出明顯的分化潛能，具有成體干細(xì)胞特性。 2、PDLSCs被攜帶SMO特異性過表達(dá)及SMO特異性RNAi慢病毒感染后，其SMO基因可呈現(xiàn)穩(wěn)定的高或低表達(dá)。 3、通過對各組細(xì)胞進(jìn)行應(yīng)力加載試驗(yàn)后檢測相關(guān)蛋白指標(biāo)提示：Hh信號對力學(xué)刺激敏感且參與了PDLSCs應(yīng)力作用下的成骨分化；力學(xué)刺激12h時具有較強(qiáng)的促成骨分化作用；Hh信號對成骨分化的作用，早期表現(xiàn)為促進(jìn)而晚期表現(xiàn)為抑制；Hh信號并非是應(yīng)力促進(jìn)PDLSCs成骨分化的唯一途徑，應(yīng)力刺激還可以通過其他通路或因子促進(jìn)PDLSCs的成骨分化。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R783.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2726085