【摘要】：目的 觀察分析不同流體剪切應(yīng)力作用下力學信號在成骨細胞內(nèi)的生物學效應(yīng)。 方法 1.細胞培養(yǎng):成骨細胞在DMEM完全培養(yǎng)液中常規(guī)條件下培養(yǎng),細胞生長接近融合成單層時,0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA常規(guī)消化,制成細胞懸液,倒置相差顯微鏡下細胞計數(shù),以10~4/ml細胞密度接種已處理好的載玻片置于CO_2孵箱(37℃,5%CO_2,95%空氣)繼續(xù)培養(yǎng),每兩天換一次液。 2.細胞成骨性能鑒定: (1)活體相差顯微鏡觀察 (2)堿性磷酸酶(ALP)染色(采用改良鈣鈷法) (3)骨鈣素(BGP)免疫組化染色(即用型SABC法) (4)礦化結(jié)節(jié)染色(茜素紅染色和von Kossa染色) 3.細胞加力: 運用定常流加載系統(tǒng),在完全密閉無菌的情況下對細胞玻片進行加力,蠕動泵可以調(diào)控液體流速,以控制流體剪切力。 4.觀察分析不同流體剪切力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用不同時間(15min,30min,60min,120min)時,力學信號對成骨細胞形態(tài)及增殖能力的影響;并且對應(yīng)力作用下成骨細胞內(nèi)骨鈣素陽性表達狀況進行了初步分析。 (1)HE染色倒置相差顯微鏡觀察展示細胞形態(tài) (2)MTT法測定細胞增殖活性 (3)用Image-pro plus圖像分析軟件處理,對細胞面積及免疫組化染色結(jié)果進行半定量分析 結(jié)果 1.不同流體剪切應(yīng)力作用對成骨細胞的形態(tài)學影響 (1)強度為7dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細胞形態(tài)及細胞面積的影響:與對照組比較,強度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min、120min時細胞形態(tài)均有變化,細胞胞突及長軸擺動方向與應(yīng)力方向趨于一致;本實驗細胞面積測定結(jié)果顯示:與對照組比較,強度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用30min、60min、120min時細胞面積變化有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但作用15min時細胞面積變化無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (2)強度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細胞形態(tài)及細胞面積的影響:與對照組比較,強度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細胞形態(tài)均有變化,細胞胞突及長軸擺動方向與應(yīng)力方向趨于一致;但本實驗中觀察到受力時間為120min時,細胞形態(tài)變化較異常,可觀察到細胞核邊集,呈現(xiàn)凋亡現(xiàn)象,細胞排列方向性不明顯。本實驗細胞平均面積測定結(jié)果顯示:強度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min和120min時細胞面積與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),而作用15min和30min與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05). (3)不同的流體剪切應(yīng)力作用(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)對成骨細胞細胞面積影響的比較分析: 本實驗細胞平均面積測定結(jié)果比較顯示:兩種不同強度的流體剪切力作用對細胞面積的影響差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05). 2.不同流體剪切應(yīng)力作用對成骨細胞增殖活性的影響 (1)強度為7dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細胞增殖活性的影響: 本實驗結(jié)果顯示:與對照組比較,強度為7dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細胞的增殖活性差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);受力組間比較表明:受力60min時細胞的增殖活性最強(P＜0.05),而受力15min與30min時細胞增殖活性之間差異無統(tǒng)計學意義. (2)強度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力對成骨細胞增殖活性的影響: 本實驗結(jié)果顯示:與對照組(0min)對比,強度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用15min、30min、60min時細胞的增殖活性差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);受力組間比較結(jié)果表明:受力60min時細胞的增殖活性明顯提高(P＜0.05),而受力15min與30min時細胞的增殖活性差異無統(tǒng)計學意義. (3)不同的流體剪切應(yīng)力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用對成骨細胞增殖活性影響的比較分析: 本實驗結(jié)果顯示:兩種不同強度(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)的剪切應(yīng)力作用對細胞增殖活性的影響差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),其中12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min時細胞的增殖活性最強。 3.強度為12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力作用不同時間對成骨細胞內(nèi)BGP陽性表達的影響: 本實驗結(jié)果顯示:與對照組(0min)比較,強度為12dynes/cm~2的流體剪切力作用60min時細胞內(nèi)BGP陽性表達差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),具有明顯促進細胞內(nèi)BGP表達增加的作用;而作用15min和30min時細胞內(nèi)BGP陽性表達差異均無統(tǒng)計學意義;受力組間比較顯示:受力60min時細胞內(nèi)BGP的陽性表達增高明顯,與受力15min、30min相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05). 結(jié)論 不同的流體剪切應(yīng)力(7dynes/cm~2和12dynes/cm~2)作用下力學信號均能引起成骨細胞內(nèi)部發(fā)生效應(yīng)性的變化,本研究結(jié)果表明了力學信號可引起成骨細胞形態(tài)、增殖活性及骨鈣素表達等發(fā)生效應(yīng)性改變,其中12dynes/cm~2的流體剪切應(yīng)力作用60min具有較強的促成骨細胞增殖分化的能力。本實驗結(jié)果將對第二階段關(guān)于流體剪切應(yīng)力下種植體細胞界面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及其關(guān)鍵功能蛋白的研究起到鋪墊和基礎(chǔ)作用。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R78
【圖文】：

圖1:MG一63細胞ALP染色:陽性細胞胞漿圖2:MG一63細胞骨鈣素(BGP)免疫組化檢測:有黑色顆粒沉著(200又)(GomoriCa一Co)陽性細胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)圖3:礦化結(jié)節(jié)染色茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)呈圖4:礦化結(jié)節(jié)vonkossa染色法染色，礦化深紅色(10Ox)結(jié)節(jié)被硝酸銀液染成黑色(IOOX).2.2正常MG-63的細胞形態(tài)

1.2.1成骨細胞性能檢測成骨細胞株MG一63堿性磷酸酶(ALP)染色(見圖l)，骨鈣素(BGP)免疫組化染色(即用型SABC法)及礦化能力檢測均呈陽性(見圖2，3，4)。圖1:MG一63細胞ALP染色:陽性細胞胞漿‘一卜奮湯.‘獷圖2:MG一63細胞骨鈣素(BGP)免疫組化檢測:有黑色顆粒沉著(200又 )(GomoriCa一Co)陽性細胞呈棕褐色(200x)(即用型ABC法)圖3:礦化結(jié)節(jié)染色茜素紅染色，礦化結(jié)節(jié)呈圖4:礦化結(jié)節(jié) vonkossa染色法染色，礦化深紅色(10Ox)結(jié)節(jié)被硝酸銀液染成黑色(IOOX)1.2.2正常MG-63的細胞形態(tài)在細胞爬片上隨機選擇視野清楚且形態(tài)清晰的視野，用倒置相差顯微鏡在20、10倍光鏡下拍照，觀察到正常未加力MG一63細胞有梭形、三角形、球形、紡錘形等多種不規(guī)則的形態(tài)，偶見癌巨細胞，多核細胞及多極分裂相細胞，核質(zhì)比例較大

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2725314