發(fā)布時(shí)間：2020-06-20 06:29

【摘要】：齲病是一種細(xì)菌感染性疾病,嚴(yán)重危害著人類(lèi)的身體健康。因此,探索控制齲病的有效措施是當(dāng)今齲病研究的緊迫任務(wù)。免疫防齲是控制齲病的有效手段之一。利用轉(zhuǎn)基因植物來(lái)制備疫苗具有生產(chǎn)簡(jiǎn)單、成本低、直接口服等優(yōu)點(diǎn)已引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。 目的：檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄中外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的表達(dá),分析果實(shí)、葉片中外源重組蛋白的含量變化,明確轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)的最佳采收時(shí)期,探討果實(shí)中外源重組蛋白表達(dá)變化的機(jī)制,獲得具有穩(wěn)定高效的表達(dá)外源重組蛋白的轉(zhuǎn)基因番茄植株個(gè)體,為下一步利用轉(zhuǎn)基因植物技術(shù)生產(chǎn)可食防齲疫苗的研究和商業(yè)化種植打下良好的基礎(chǔ)。 方法：提取轉(zhuǎn)基因番茄可溶性蛋白,Western blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)中外源重組蛋白PAcA/CTB,PAcP/CTB表達(dá);ELISA法檢測(cè)果實(shí)、葉片中外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB占可溶性總蛋白含量變化。 1提取轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)可溶性蛋白,并采用Western blot法檢測(cè)外源重組蛋白在果實(shí)中的表達(dá),并分別統(tǒng)計(jì)含外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄F0, F1, F2, F3代外源重組蛋白表達(dá)陽(yáng)性率及總體表達(dá)陽(yáng)性率。 2提取轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實(shí)可溶性總蛋白,采用ELISA法檢測(cè)外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB在轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實(shí)的表達(dá)含量。 1)轉(zhuǎn)基因番茄的培養(yǎng)及大田種植； 2)采樣,植物開(kāi)花坐果期每7d采集幼嫩葉片及果實(shí)樣本； 3)BCA法分別測(cè)定轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)樣本和幼嫩葉片樣本中可溶性總蛋白的含量； 4) ELISA法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)基因番茄葉片和果實(shí)外源重組蛋白的濃度,并根據(jù)可溶性總 蛋白含量計(jì)算出外源重組蛋白含量百分比； 5)通過(guò)觀察外源重組蛋白含量百分比的變化,研究以下內(nèi)容： A.轉(zhuǎn)基因番茄F0, F1, F2, F3代在相同時(shí)間外源重組蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB表達(dá)差異； B.轉(zhuǎn)基因番茄葉片與果實(shí)中外源重組蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB的表達(dá)隨轉(zhuǎn)基因番茄植株生長(zhǎng)的含量變化差異； C.單株轉(zhuǎn)基因番茄坐果期不同果實(shí)在表達(dá)外源重組蛋白含量的差異。 結(jié)果： 1.提取的可溶性總蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離出的蛋白條帶,Western blot免疫印記雜交,曝光后證實(shí)該條帶分子量約5.5×104KDa大小,與預(yù)計(jì)的外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的分子量相吻合； 2.提取的蛋白樣品經(jīng)Western blot檢測(cè),轉(zhuǎn)基因番茄外植株中表達(dá)外源重組蛋白PAcA/CTB共有31株(F0代9株,F1代9株,F2代7株,F3代6株),轉(zhuǎn)基因番茄外源重組蛋白PAcA/CTB表達(dá)陽(yáng)性率為70.45%；表達(dá)外源重組蛋白PacP/CTB共有28株(F0代9株,F1代8株,F2代4株,F3代7株),轉(zhuǎn)基因番茄外源重組蛋白PAcP/CTB表達(dá)陽(yáng)性率為63.6%。轉(zhuǎn)基因番茄外源重組蛋白PAcA/CTB和PAcP/CTB表達(dá)陽(yáng)性率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.提取果實(shí)可溶性蛋白樣本經(jīng)BCA法測(cè)量可溶性總蛋白含量,ELISA檢測(cè)外源重組蛋白含量,計(jì)算外源重組蛋白占可溶性總蛋白含量。同期外源重組蛋白表達(dá)含外源重組蛋白PAcA/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄F0代0.248%,F1代0.088%,F2代0.103%,F：；代0.078%；含外源重組蛋白PAcP/CTB的轉(zhuǎn)基因番茄F0代0.308%,F,代0.300%,F2代0.278%,F3代0.176%。 4.番茄果實(shí)中外源重組蛋白均在開(kāi)花坐果期的第6-8周達(dá)到最高。外源重組蛋白PAcA/CTB含量在6-8周分別為0.236%,0.276%,0.257%；外源重組蛋白PAcP/CTB含量在6-8周分別為0.568%,0.600%,0.554%。 5.單株轉(zhuǎn)基因番茄坐果期成熟果實(shí)表達(dá)外源重組蛋白含量。A15果實(shí)外源重組蛋白表達(dá)含量水平分別為0.627%,0.467%,0.463%；A17果實(shí)外源在蛋白表達(dá)含量水平分別為0.379%,0.496%,0.233%；P區(qū)P15果實(shí)外源重組蛋白表達(dá)含量水平分別為0.580%,0.481%,0.758%；P19果實(shí)表達(dá)外源重組蛋白含量水平分別為0.498%,0.692%,0.597%。 結(jié)論： 1.在F0,F1,F2,F3代轉(zhuǎn)基因番茄中均有植株的果實(shí)中成功表達(dá)了外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB。番茄中表達(dá)外源蛋白陽(yáng)性率較高,轉(zhuǎn)基因番茄外源蛋白的表達(dá)較為穩(wěn)定。 2.在F0, F1, F2, F3代轉(zhuǎn)基因番茄中,外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB表達(dá)含量均較高,在果實(shí)中外源重組蛋白PAcP/CTB表達(dá)效率高于外源重組蛋白PAcA/CTB的表達(dá)。 3.轉(zhuǎn)基因番茄植株果實(shí)表達(dá)外源蛋白的效率高于葉片。 4.外源重組蛋白PAcP/CTB表達(dá)比重在坐果期均較表達(dá)外源蛋白PAcA/CTB植株更高；轉(zhuǎn)基因番茄外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的表達(dá)同時(shí)在坐果期的6—8周達(dá)最高。 5.相同時(shí)間單株轉(zhuǎn)基因番茄不同成熟果實(shí),表達(dá)外源重組蛋白PAcA/CTB, PAcP/CTB的含量比重均有差異。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R781.1
【圖文】：

轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)FigZThefrultsofTransgenietomato

2、 westernblot檢測(cè)結(jié)果}蟹光圖片結(jié)果顯示，含有外源幣組蛋白的轉(zhuǎn)基因悉茄果實(shí)提取的蛋白樣本在相對(duì)分子質(zhì)員約為55KDa處出現(xiàn)了低密度條帶(圖3)

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 錢(qián)昱霏;劉建國(guó);白國(guó)輝;管曉燕;韓琪;白朋元;;轉(zhuǎn)基因番茄中外源目的蛋白提取液的篩選[J];遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2013年02期

本文編號(hào)：2722017