【摘要】： 前言 組織工程技術(shù)是創(chuàng)傷修復(fù)領(lǐng)域的新興技術(shù),使應(yīng)用少量組織獲取大量細(xì)胞并用于修復(fù)大塊組織缺損成為可能,有學(xué)者將培養(yǎng)好的口腔粘膜上皮片覆蓋修復(fù)患者口腔粘膜缺損,避免了供皮區(qū)的負(fù)損傷。目前,用于修復(fù)皮膚缺損的組織工程皮膚有Apligraft,用組織工程真皮修復(fù)人皮膚缺損的,僅是美國(guó)的Dermagraft。體外研究發(fā)現(xiàn),組織工程口腔粘膜固有層中的口腔粘膜成纖維細(xì)胞(oral mucosa fibroblast OMF),比相同條件下人工真皮中的皮膚成纖維細(xì)胞有更強(qiáng)的重塑細(xì)胞外基質(zhì)的能力,和更強(qiáng)的減少瘢痕的能力,皮膚成纖維細(xì)胞和OMF同源于胚胎時(shí)期的中胚層組織,因此,本文用大鼠OMF、鼠尾1型膠原、殼多糖構(gòu)建組織工程固有層后,同種異體移植修復(fù)大鼠口腔頰粘膜全層缺損區(qū),修復(fù)大鼠背部皮膚圓形全層缺損區(qū),對(duì)手術(shù)后受植區(qū)的發(fā)展變化和愈合過(guò)程進(jìn)行研究。 頜面部創(chuàng)口愈合是口腔外科醫(yī)生遇到的基本問(wèn)題,而至今未見(jiàn)唇裂術(shù)后上唇瘢痕組織形態(tài)的報(bào)道;皮膚真皮組織已被用于整形手術(shù)的皮下充填和隆起外形上,未見(jiàn)將口腔粘膜固有層移植于皮膚創(chuàng)口表皮下方的研究報(bào)道。因此本文對(duì)患兒唇裂術(shù)后瘢痕組織形態(tài)進(jìn)行研究;利用唇裂手術(shù)中將扔掉的唇粘膜組織,自體移植于皮膚切口內(nèi),觀察移植術(shù)后的發(fā)展變化。 材料和方法 1.1材料 主要試劑;DMEM,胰蛋白酶,胎牛血清,1.8～1.9mg/ml鼠尾Ⅰ型膠原;大鼠尾由我校提供,殼多糖,兩性霉素B。 病理取材;標(biāo)本取自在我口腔外科做過(guò)唇裂手術(shù)的再住院患者(7例),在患者唇鼻再修整術(shù)中,將上唇較寬的線狀瘢痕取下,10%中性福爾馬林液中固定,石蠟包埋,5μm切片,1例瘢痕的部分取下立即放于2.5%戊二醛固定。7例患兒均無(wú)瘢痕隆起和瘢痕疙瘩。 移植手術(shù)中口腔粘膜固有層來(lái)源;選擇21例來(lái)我科行單側(cè)唇裂修復(fù)術(shù)患者(伴有腭裂),3月至5月齡,將切下的唇紅粘膜去掉上皮和脂肪組織,約0.5×0.4×0.10cm~3大小的粘膜固有層剪碎后,放入無(wú)菌生理鹽水,備用。 1.1.2主要器械;CO_2培養(yǎng)箱,超凈工作臺(tái),倒置相差顯微鏡,低溫高速離心機(jī),24孔板,游標(biāo)卡尺,JEM-1200EX透射電鏡。 1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與方法 Wistar大鼠,21周至25周齡,體健,由我校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。 1.2.1種子細(xì)胞的獲取及培養(yǎng);組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行,大鼠頰、腭粘膜成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng),培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM液(serum contai-ning medium SCM)。胰酶消化,按1;3比例傳代培養(yǎng)。 1.2.2膠原網(wǎng)架組織工程口腔粘膜固有層(Fibroblast—populated col-lagen lattice FPCL)的制作,將第5至9代OMF制成細(xì)胞懸液,按文獻(xiàn)中的配方,在24孔板中制成,每孔0.4ml,內(nèi)含細(xì)胞3.5×10~4,置37℃,5%CO_2孵箱中,1h后凝固,每孔加入0.3ml SCM,3天換液一次。 1.2.3殼多糖膠原網(wǎng)架組織工程口腔粘膜固有層(Fibroblast—popula-ted chitosan collagen lattice FPCCL)的制作;將第5至9代OMF制成細(xì)胞懸液,參照朱氏方法加入細(xì)胞懸液,混勻,將該混合液吸入24孔板中,其余操作同上。 1.2.4細(xì)胞標(biāo)記;24孔板中FPCL和FPCCL制成后第3天,以含10μM BrdU的上述SCM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后,換SCM,備移植手術(shù)用。 1.2.5頰粘膜缺損動(dòng)物模型制作和分組;21至25周齡Wistar大鼠21只,分為二組,對(duì)照組9只;FPCCL移植組12只。大鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)。 以上動(dòng)物的手術(shù)過(guò)程;大鼠被麻醉后,按照無(wú)菌手術(shù)要求,將大鼠口周、口腔內(nèi)消毒,用自制直徑0.8cm圓形無(wú)菌刀,在大鼠一側(cè)頰粘膜上做圓形全層粘膜缺損區(qū),深達(dá)肌肉,即為此模型,實(shí)驗(yàn)組將培養(yǎng)5天的FPCCL膜取出,無(wú)菌剪刀修剪,平放于頰粘膜缺損區(qū),覆蓋凡士林油紗和干紗布,荷包縫扎固定。對(duì)照組;頰粘膜缺損區(qū)直接暴露。術(shù)后單籠常規(guī)飼養(yǎng),不給予抗感染藥物,術(shù)后七日拆線。 術(shù)后大鼠頰部組織取材活檢時(shí)間安排及取材方法;術(shù)后第7、14、21天時(shí)取材,大鼠被麻醉后,取下受植區(qū)及對(duì)照組創(chuàng)面全層新生組織,甲醛固定,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,備用。 組織染色法;將以上三天的石蠟切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,將第7、14天的石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色,按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。 1.2.6全層皮膚缺損動(dòng)物模型制作和分組;Wistar大鼠41只,分為三組,對(duì)照組13只;FPCL移植組14只;FPCCL移植組14只。 手術(shù)過(guò)程;按同樣方法,在大鼠背部中央做1個(gè)圓形全層皮膚缺損區(qū),即為全層皮膚缺損動(dòng)物模型。對(duì)照組的皮膚缺損區(qū)直接敷以無(wú)菌油紗;將培養(yǎng)5天的FPCL膜和FPCCL膜取出,無(wú)菌剪刀修剪,分別平放于皮膚缺損區(qū),然后覆蓋凡士林油紗和干紗布,荷包縫扎,固定。 大鼠術(shù)后皮膚組織取材活檢時(shí)間安排及取材方法;術(shù)后第4、7、14、21和26天時(shí)取材,取下受植區(qū)全層新生組織,10%甲醛固定,石蠟包埋,5μm連續(xù)切片,備用。 組織染色法;將以上五天的石蠟切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,將以上術(shù)后第4、7、14、21天的石蠟切片進(jìn)行SP法免疫組化染色,按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,DAB顯色。 1.2.7將以上唇裂的石蠟切片行H、E染色,Weigert彈力纖維染色,戊二醛固定的標(biāo)本常規(guī)處理,透視電鏡觀察。 1.2.8手術(shù)方法;下三角瓣法,鼻檻區(qū)域肌層縫合后,將上述剪碎的固有層組織放入該區(qū)域的真皮與皮下層位置,然后縫合該處皮膚。術(shù)后隨訪觀察記錄。 1.3觀察指標(biāo); 1.3.1大體觀察;在術(shù)后第1、4、7、14和21天,觀察五組大鼠有無(wú)感染發(fā)生,創(chuàng)面愈合情況,有無(wú)移植物脫落,有無(wú)出血。鼻檻區(qū)手術(shù)切口愈合情況。 1.3.2創(chuàng)面大小測(cè)量及統(tǒng)計(jì)比較;術(shù)后第4、7、14和21天,將三組大鼠的背部創(chuàng)面和術(shù)后第4、7、14天,另二組大鼠的口內(nèi)頰部創(chuàng)面,按照Ste-phens方法,測(cè)量每個(gè)創(chuàng)面直徑,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,統(tǒng)計(jì)分析。 1.3.3光學(xué)顯微鏡下觀察,頰粘膜缺損動(dòng)物模型組術(shù)后第7、14、21天的愈合情況;皮膚缺損動(dòng)物模型組術(shù)后第4、7、14、21和26天的愈合情況。以細(xì)胞核呈深棕色著色為BrdU陽(yáng)性細(xì)胞。患者唇裂瘢痕組織結(jié)構(gòu)。 1.3.4電鏡下觀察,唇裂瘢痕中OMF的情況。 結(jié)果 2.1大體觀察;頰粘膜缺損動(dòng)物模型組,術(shù)后第4天FPCCL組12只大鼠中,9只大鼠頰部荷包在位良好,無(wú)明顯紅腫。術(shù)后第七天拆線,受植區(qū)創(chuàng)口被淺黃色膜覆蓋,周圍無(wú)紅腫。術(shù)后14天,FPCCL新生粘膜表面有光澤,顏色與周圍粘膜顏色相似。移植術(shù)后第21天FPCCL組新生粘膜色澤同周圍組織的一致。 皮膚缺損動(dòng)物模型組,術(shù)后第1天FPCL組和FPCCL組各有一只大鼠背部荷包被爪抓掉,其余26只大鼠術(shù)后均未發(fā)生感染。移植第7天,三組創(chuàng)面均被結(jié)痂或少許紗布覆蓋。移植第14天,FPCL組大鼠創(chuàng)口結(jié)痂均脫落,創(chuàng)面完全被新生表皮覆蓋。FPCCL組與對(duì)照組各一例受植區(qū)新生皮中央有少許結(jié)痂(第17天脫落),其余受植區(qū)情況與FPCL組的一致。移植第21天,三組大鼠背部所有創(chuàng)面的新生皮膚光滑,顏色與正常皮膚色相似,均無(wú)體毛。 2.2創(chuàng)面直徑測(cè)量結(jié)果;頰粘膜缺損動(dòng)物模型組,移植第7天時(shí),FPCCL組的直徑與對(duì)照組間有顯著差異(P＜0.05),第14天時(shí),無(wú)顯著差異。皮膚缺損動(dòng)物模型組,移植第7天時(shí),FPCL組與FPCCL組、對(duì)照組有非常顯著差異(P＜0.01),第14、21天時(shí),無(wú)顯著差異,FPCCL組直徑最大(P＞0.05)。 2.3顯微鏡下觀察;頰粘膜缺損動(dòng)物模型中,術(shù)后第七天,FPCCL組創(chuàng)面不完全被薄層新生上皮細(xì)胞覆蓋。固有層中新生肉芽組織富含毛細(xì)血管、炎性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞。免疫組化染色見(jiàn)陽(yáng)性成纖維細(xì)胞分布于固有層中。植入的凝膠網(wǎng)架顏色、形態(tài)與周圍組織無(wú)法區(qū)別。 移植術(shù)后14天,FPCCL組新生上皮厚,有較大的釘突,固有層中成纖維細(xì)胞與炎性細(xì)胞仍較密集,毛細(xì)血管數(shù)量稍較術(shù)后第7天時(shí)減少。免疫組化染色,可見(jiàn)固有層中的陽(yáng)性成纖維細(xì)胞。對(duì)照組新生上皮釘突明顯,上皮細(xì)胞3至4層。 術(shù)后第21天,FPCCL組新生上皮厚,釘突粗大。新生固有層中細(xì)胞數(shù)量減少,有少量毛細(xì)血管,可見(jiàn)固有層中BrdU陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞。對(duì)照組新生黏膜結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)組的相似。 皮膚缺損動(dòng)物模型組,移植術(shù)后第4天,FPCL組、FPCCL組受植創(chuàng)面最表面壞死組織,與下方肉芽組織分離。肉芽組織中有大量炎性細(xì)胞,和較多長(zhǎng)梭型成纖維細(xì)胞,新生毛細(xì)血管。新生組織中細(xì)胞非常密集。免疫組化染色顯示,陽(yáng)性成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在新生肉芽組織中,對(duì)照組創(chuàng)面中病理組織結(jié)構(gòu)與實(shí)驗(yàn)組類似。術(shù)后第7天,以上兩實(shí)驗(yàn)組受植創(chuàng)面表皮細(xì)胞正在生長(zhǎng),呈劍尖狀向肉芽組織與壞死組織之間穿行。免疫組化染色顯示,陽(yáng)性成纖維細(xì)胞出現(xiàn)在肉芽組織的細(xì)胞最密集處。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組結(jié)構(gòu)相似。移植第14天,兩實(shí)驗(yàn)組受植區(qū)完全表皮化,有釘突,表皮已分層,基底細(xì)胞層完整,最表面有角化物,新生真皮中可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性O(shè)MF,對(duì)照組創(chuàng)面已完全表皮化,無(wú)釘突。移植術(shù)后第21天兩實(shí)驗(yàn)組完全表皮化,可見(jiàn)釘突,真皮中新生膠原纖維細(xì)小,含較多毛細(xì)血管。BrdU陽(yáng)性成纖維細(xì)胞在真皮中仍能看到。對(duì)照組完全表皮化,釘突極少,基底細(xì)胞層完整,其淺面有1～2層細(xì)胞,最表面是角化層,新生瘢痕組織與正常皮膚相比仍有較多的毛細(xì)血管,真皮層中的細(xì)胞間質(zhì)纖維仍沒(méi)有正常真皮的粗大。術(shù)后26天,兩實(shí)驗(yàn)組在H E染色下的新生組織結(jié)構(gòu)與術(shù)后第21天的非常相似。 2.4對(duì)患者的研究;光學(xué)顯微鏡下,唇裂皮膚切口瘢痕組織表皮層細(xì)胞分層清晰;基底細(xì)胞層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角化層,偶見(jiàn)微小的表皮釘突,使基底膜時(shí)常與皮膚表面平行。而上唇粘膜瘢痕中上皮細(xì)胞分層清晰,從深層至淺層依次為;基底細(xì)胞層、中間層和表層,上皮釘突長(zhǎng)而大。皮膚瘢痕的真皮層中,膠原纖維呈粗大的束狀,伴纖細(xì)的彈力纖維,缺少小動(dòng)、靜脈和皮膚附屬器。成纖維細(xì)胞數(shù)量少,核的形態(tài)為長(zhǎng)梭形。上唇口腔粘膜瘢痕固有層中,易見(jiàn)毛細(xì)血管,形成的固有層乳頭區(qū)富含血管,數(shù)量比瘢痕真皮乳頭區(qū)的血管數(shù)量多。固有層中膠原纖維束細(xì),彈力纖維極少,成纖維細(xì)胞數(shù)量少,呈長(zhǎng)梭形。電鏡下,粘膜瘢痕中成纖維細(xì)胞,細(xì)胞漿不豐滿,缺少發(fā)達(dá)的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng);皮膚瘢痕中,2個(gè)成纖維細(xì)胞,胞漿不豐滿,形態(tài)細(xì)長(zhǎng)。 2.5 21例唇裂手術(shù)后患兒,術(shù)后7天觀察中,鼻檻區(qū)域即唇組織自體移植區(qū)的皮膚和手術(shù)切口,無(wú)明顯紅腫,皮膚創(chuàng)口甲級(jí)愈合。15例術(shù)后一年半后隨訪,1例術(shù)后4年隨訪,見(jiàn)移植粘膜固有層的鼻檻處手術(shù)瘢痕平坦,質(zhì)地、顏色與周圍皮膚一致;2例未到腭裂手術(shù)時(shí)間;3例未再到我科做腭裂手術(shù)。 結(jié)論 1.OMF做為修復(fù)重建頰粘膜全層缺損、皮膚缺損的新種子細(xì)胞是可行和有效的。 2.膠原凝膠、殼多糖-膠原凝膠組織相容性良好,起粘膜固有層、皮膚真皮的細(xì)胞外基質(zhì)作用。殼多糖-膠原凝膠在動(dòng)物體內(nèi)限制受植區(qū)收縮變小方面優(yōu)于單純膠原凝膠。 3.FPCL和FPCCL兩種組織工程口腔粘膜固有層做為頰粘膜缺損、皮膚缺損區(qū)永久性替代物是可行和有效的。FPCL和FPCCL兩組新生皮膚的質(zhì)量高于對(duì)照組的。 4.患兒唇粘膜手術(shù)切口瘢痕不同于唇皮膚切口瘢痕的特點(diǎn);前者形成的釘突長(zhǎng)而大,固有層乳頭狹長(zhǎng),幾乎達(dá)新生上皮表面,乳頭中富含毛細(xì)血管,膠原纖維束較細(xì),彈力纖維極少。 5.患兒唇粘膜固有層自體移植于上唇皮膚切口內(nèi)無(wú)排斥反應(yīng),是可行的;自體移植的固有層組織對(duì)皮膚創(chuàng)口的愈合具有促進(jìn)作用。提供了臨床參考。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R782
【圖文】：

每3天換液一次。1.2.3細(xì)胞標(biāo)記:24孔板中FPCCL制成后第3天，以含10林MB記U的SCM培養(yǎng)液培養(yǎng)48h后，換常規(guī)培養(yǎng)液，備移植手術(shù)用(圖2)。1.2.4動(dòng)物的分組:21至25周齡Wistal大鼠21只，分為二組，對(duì)照組9只;殼多糖一膠原網(wǎng)架組織工程固有層移植組(FPCCL)12只。大鼠在常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自由飲用自來(lái)水，攝食，每3日換墊料。_ 1.2.5動(dòng)物的手術(shù)過(guò)程:大鼠被10%水合氯醛腹腔麻醉后，按照無(wú)菌手術(shù)要求，將大鼠口周、口腔內(nèi)消毒，用自制直徑0.scm圓形無(wú)菌刀在大鼠一側(cè)頰粘膜上做圓形全層粘膜缺損區(qū)，深達(dá)肌肉，即為頰粘膜缺損區(qū)動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組將培養(yǎng)5天的FPCCL膜取出，無(wú)菌剪刀修剪，平放于頰粘膜缺損區(qū)

一95%鋪滿后的OMF(倒置相差顯微鏡x400)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2717137