發(fā)布時間：2020-06-17 01:53

【摘要】：研究背景牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織的慢性感染性疾病,是造成成人牙齒喪失的主要原因,并對人全身健康造成重要影響。國際臨床調查結果顯示,絕大多數成年人都患有輕中度牙周炎,其中,高達15%的成年人患有重度牙周炎。2003年WHO組織將惡性腫瘤、心血管疾病、牙周炎并列為危害人類健康、需要重點防治的“三大疾病”。由此可見,牙周炎是國際醫(yī)藥衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的重要疾病,然而牙周炎治療目前臨床缺乏有效應對措施,牙周缺損的修復更是目前國際關注的難題�，F階段臨床常用的治療方法比如齦下刮治、根面平整和牙周翻瓣等治療方法可以有效去除致病因子、控制進展性炎癥以及促進組織修復。90年代用于牙周治療的其他方法如牙周骨移植(bone grafting)、引導組織/骨再生技術(guided tissue/bone regeneration,GTR/GBR),雖然給牙周炎治療帶來新的思路和方法,也在一些特定條件下,獲得了不同程度的牙周組織再生,但是這些治療方法都無法真正意義上重建破壞的牙齒支持結構(如牙槽骨-牙周膜-牙骨質結構),使其恢復正常組織結構并正常行使生理性功能。近20年來,干細胞和再生醫(yī)學研究取得重要進展,利用再生醫(yī)學的原理、干細胞技術等促進牙周再生也成為一個嶄新的研究領域。已有大量的基礎和動物體內研究將干細胞(例如骨髓和牙周膜組織來源的干細胞)與基質材料(支架)結合促進牙周支持結構再生,并取得重要研究進展。研究證實,來源于牙周膜的干細胞(periodontal ligament-derived stem cells,PDLSCs)是牙周組織自我修復的主體細胞。一些臨床前期試驗和小規(guī)模臨床觀察結果提示,PDLSCs用于治療牙周支持組織破壞,具有傳統(tǒng)治療無法達到的優(yōu)勢。然而,干細胞治療修復牙周缺損的安全性和有效性,目前尚缺少真正的臨床對照試驗證實。干細胞治療為牙周炎的治療和牙周組織缺損修復帶來了新希望。然而,目前臨床前期治療方案中關于干細胞數量及移植模式等仍缺乏最佳標準,其中最簡單易行的方法是細胞懸液注射�？墒沁@種方式細胞存活率低、容易產生不良反應,因此多數細胞治療均采用細胞膜片的方式。細胞膜片工程技術的快速發(fā)展使這種無支架細胞植入方法成為細胞治療的常用手段之一。細胞膜片是細胞與細胞外基質(extracellular matrix,ECM)的聚合體,既保存了細胞生長的微環(huán)境,又維持了細胞的生物學性能、細胞間連接以及細胞基質,大大提高了細胞移植的成活率。因此,本課題設計一個單中心、前瞻性、連續(xù)性隨機臨床對照試驗研究,初步評估應用自體PDLSC膜片復合目前臨床常用的骨材料(Bio-Oss~?)治療牙周骨下袋缺損的安全性和有效性。由于現階段還處在干細胞牙周治療的初級階段,本試驗的主要目的是評價干細胞用于牙科領域的安全性。自體PDLSCs來源于患者自體牙周膜組織,由于牙周炎的患者多為中老年人,所以在完成臨床試驗期間,我們對來源于42個個體的62顆牙齒來源的干細胞,按照年齡進行分組,對比分析不同年齡組個體來源的PDLSCs及其細胞膜片的生物學特征和再生潛能,探索年齡因素對PDLSCs及其細胞膜片的影響,為進一步大樣本、多中心臨床試驗的開展提供參考和借鑒。方法1.制定符合臨床試驗的自體牙周膜干細胞膜片制備和運送流程:拔除患者無保留價值的牙齒,運送到具有臨床細胞培養(yǎng)資格的實驗室,從牙根表面中1/3分離殘留牙周膜組織,按照制定的標準程序,分離、純化、培養(yǎng)PDLSCs并制備PDLSC膜片,按照規(guī)定流程和條件,運送至臨床試驗管理護士,備用。2.制定《自體牙周膜干細胞復合煅燒骨修復牙周炎所致骨下袋牙周缺損的臨床研究》臨床研究方案,通過第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院臨床試驗倫理委員會審查。根據納入和排除標準,納入患者按照牙齒隨機分組原則分為對照組(GTR手術配合Bio-oss骨粉植入)和細胞組(GTR手術配合PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入),歷經12個月的隨訪,根據不良事件發(fā)生的頻率和程度評價干細胞牙周治療的安全性,根據牙周手術后3個月、6個月和12個月骨再生情況及其相關臨床指標評價有效性。3.收集臨床因阻生、無無功能等原因拔除的第三磨牙,根據供體年齡,將牙齒分為A(18-30歲)、B(31-45歲)、C(46-62歲)三組,按照臨床試驗標準,分離培養(yǎng)PDLSCs。在細胞水平,通過CFU-F測定、MTT實驗、流式細胞儀檢測、細胞成骨、成脂分化能力、衰老相關的β-半乳糖苷酶(SA-βG)染色、細胞多能性相關轉錄因子的表達等方法評估不同年齡組PDLSCs的生物學活性。在細胞膜片水平,通過細胞膜片形態(tài)表征、ALP活性測定、蛋白形成能力和成骨基因表達分析等方法,評估細胞膜片再生潛能。本實驗不僅為臨床試驗結果的分析、評價提供細胞層面的參考,也為進一步設計大規(guī)模、多中心同類試驗提供重要數據資料。結果1.臨床試驗中心提供的24顆牙齒,除2顆沒能正常獲得可供膜片制備的PDLSCs外,其余牙齒均獲得滿足臨床使用要求的細胞膜片。膜片制備、轉運過程中,無意外或影響細胞安全的事件發(fā)生。2.本實驗共有30位牙周炎患者、48顆骨下袋缺損的牙齒符合納入和排除標準,年齡分布從18至65歲。48顆牙齒隨機分成對照組和細胞組,排除骨缺損不合要求、細胞培養(yǎng)失敗等原因,最后對照組21顆牙齒成功接受GTR+Bio-oss骨粉植入治療,實驗組20顆牙齒成功接受GTR+PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入治療。隨訪期間,安全性評估未發(fā)現因PDLSCs植入引起的任何不良事件。有效性評估結果顯示,兩組患牙治療后3月、6月和12月,牙槽骨的高度在骨下袋缺損處均有明顯增加,且隨時間延長,骨缺損面積縮小,有統(tǒng)計學差異(P0.001)。但對照組和細胞組兩組間比較,差異并無統(tǒng)計學意義(P(29)0.05)。3.從不同年齡組供體獲得的PDLSCs,增殖潛能、成骨分化潛能以及多能性相關轉錄因子的表達均隨年齡增加而呈現降低的趨勢。此外,SA-βG染色結果顯示PDLSCs隨著年齡增加,細胞SA-βG陽性率增加。通過電鏡掃描和Ki-67免疫組化染色顯示,年老PDLSCs形成細胞膜片的能力較年輕PDLSCs減弱。根據細胞膜片ECM蛋白含量(包括纖連蛋白、整聯蛋白β1和COL-I)和ALP活性測定,成骨相關基因檢測(ALP、Runx2和骨鈣素)等實驗發(fā)現,來源于老年PDLSCs的細胞膜片的成骨潛能弱于年輕組PDLSCs誘導的細胞膜片。結論1.從臨床拔除患牙中獲取人PDLSCs,方法可靠、技術成熟。本實驗建立的臨床人PDLSC膜片的制備和轉運標準可以在同類試驗中推廣。2.自體PDLSCs治療牙周炎所致骨下袋缺損,切實可行、安全可靠。雖然本試驗結果并沒有顯示細胞治療組獲得更多的牙周組織再生,但病例數少、年齡因素對細胞膜片再生潛能的差異、細胞載體材料Bio-Oss的細胞相容性問題,可能對本試驗的結果會產生干擾。自體PDLSCs治療牙周炎所致骨下袋缺損的有效性需要進一步多中心、大規(guī)模的隨機對照臨床試驗來驗證。3.年齡因素對自體PDLSCs和自體PDLSC膜片的生物學性能產生重要影響,進一步類似臨床試驗設計中,必需加以考慮。4.口腔疾病防治領域是轉化醫(yī)學的沃土,病員豐富、臨床需求廣泛。牙周病防治是一個嚴峻的社會問題,在發(fā)展中國家尤為突出;迄今為止,臨床上缺乏有效的防治措施。如何盡早引入轉化醫(yī)學理念,立足臨床疾病治療,將實驗室新發(fā)現、新成果轉化并用于疾病治療,是牙周炎診療水平全面整體提升的關鍵舉措。
【學位授予單位】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R781.4
【圖文】：

20 世紀以來，隨著組織工程技術的飛速發(fā)展和牙周膜干細胞的發(fā)現，如何利用組織工程原理和技術、通過體外培養(yǎng)干細胞促進牙周支持組織再生，成為口腔醫(yī)學研究領域的熱門課題，也必將對牙周炎的臨床治療將產生深遠影響[6]。同時，牙周組織涉及牙槽骨（alveolar bone）、牙周韌帶（periodontal ligament）和牙骨質（cementum）三種完全不同的組織，這些組織形成復雜的結構和功能（骨-牙周膜-牙骨質），因此牙周組織再生可以作為機體復雜組織器官再生的 模型 （圖 1）。由此可見，牙周再生策略和機理研究的意義，未來可能遠遠超過牙周疾病治療本身[4]。研究表明，國內外研究者主要將干細胞體外培養(yǎng)擴增后通過一定技術將干細胞移植至損傷區(qū)域的方法，以達到牙周組織再生的目的，然而，高標準的干細胞體外培養(yǎng)技術、嚴格的體外調控措施和復雜的移植技術使牙周再生技術的臨床轉化面臨大量人力、物力和財力等多方面的挑戰(zhàn)，特別是針對牙周炎等非致死性疾病的治療，高投入、高風險和低回報成為橫跨在基礎研究與臨床應用之間的巨大鴻溝[18]。

空軍軍醫(yī)大學博士學位論文問題。雖然目前已有干細胞牙周治療的嘗試，其臨床安全性、有效性還缺乏嚴謹設計的臨床對照試驗來證實[11,14,15]�？傊�，第三個階段治療方法以有效的牙周基礎治療為基礎，在 GTR\GBR 大量臨床實踐的基礎上，通過轉化醫(yī)學研究的方法和手段，把現有干細胞生物學研究的最新成果盡快推進到臨床疾病治療，具有重要意義和深遠影響，不僅對牙周病臨床治療帶來新的機遇，也為再生牙科學其它領域的研究提供參考和借鑒[26-28]。

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 王方;謝誠;吳國鋒;趙銥民;;組織工程牙周膜細胞片的體內實驗研究[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2011年02期

2 蔣學武;;哈佛大學醫(yī)學院轉化醫(yī)學實踐的啟示[J];中華醫(yī)學雜志;2010年22期

3 曹采方;;淺談用轉化醫(yī)學的理念指導牙周病的防與治[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2009年06期

本文編號：2716903