【摘要】：研究背景牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織的慢性感染性疾病,是造成成人牙齒喪失的主要原因,并對(duì)人全身健康造成重要影響。國(guó)際臨床調(diào)查結(jié)果顯示,絕大多數(shù)成年人都患有輕中度牙周炎,其中,高達(dá)15%的成年人患有重度牙周炎。2003年WHO組織將惡性腫瘤、心血管疾病、牙周炎并列為危害人類健康、需要重點(diǎn)防治的“三大疾病”。由此可見(jiàn),牙周炎是國(guó)際醫(yī)藥衛(wèi)生系統(tǒng)面臨的重要疾病,然而牙周炎治療目前臨床缺乏有效應(yīng)對(duì)措施,牙周缺損的修復(fù)更是目前國(guó)際關(guān)注的難題�，F(xiàn)階段臨床常用的治療方法比如齦下刮治、根面平整和牙周翻瓣等治療方法可以有效去除致病因子、控制進(jìn)展性炎癥以及促進(jìn)組織修復(fù)。90年代用于牙周治療的其他方法如牙周骨移植(bone grafting)、引導(dǎo)組織/骨再生技術(shù)(guided tissue/bone regeneration,GTR/GBR),雖然給牙周炎治療帶來(lái)新的思路和方法,也在一些特定條件下,獲得了不同程度的牙周組織再生,但是這些治療方法都無(wú)法真正意義上重建破壞的牙齒支持結(jié)構(gòu)(如牙槽骨-牙周膜-牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)),使其恢復(fù)正常組織結(jié)構(gòu)并正常行使生理性功能。近20年來(lái),干細(xì)胞和再生醫(yī)學(xué)研究取得重要進(jìn)展,利用再生醫(yī)學(xué)的原理、干細(xì)胞技術(shù)等促進(jìn)牙周再生也成為一個(gè)嶄新的研究領(lǐng)域。已有大量的基礎(chǔ)和動(dòng)物體內(nèi)研究將干細(xì)胞(例如骨髓和牙周膜組織來(lái)源的干細(xì)胞)與基質(zhì)材料(支架)結(jié)合促進(jìn)牙周支持結(jié)構(gòu)再生,并取得重要研究進(jìn)展。研究證實(shí),來(lái)源于牙周膜的干細(xì)胞(periodontal ligament-derived stem cells,PDLSCs)是牙周組織自我修復(fù)的主體細(xì)胞。一些臨床前期試驗(yàn)和小規(guī)模臨床觀察結(jié)果提示,PDLSCs用于治療牙周支持組織破壞,具有傳統(tǒng)治療無(wú)法達(dá)到的優(yōu)勢(shì)。然而,干細(xì)胞治療修復(fù)牙周缺損的安全性和有效性,目前尚缺少真正的臨床對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)。干細(xì)胞治療為牙周炎的治療和牙周組織缺損修復(fù)帶來(lái)了新希望。然而,目前臨床前期治療方案中關(guān)于干細(xì)胞數(shù)量及移植模式等仍缺乏最佳標(biāo)準(zhǔn),其中最簡(jiǎn)單易行的方法是細(xì)胞懸液注射。可是這種方式細(xì)胞存活率低、容易產(chǎn)生不良反應(yīng),因此多數(shù)細(xì)胞治療均采用細(xì)胞膜片的方式。細(xì)胞膜片工程技術(shù)的快速發(fā)展使這種無(wú)支架細(xì)胞植入方法成為細(xì)胞治療的常用手段之一。細(xì)胞膜片是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的聚合體,既保存了細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境,又維持了細(xì)胞的生物學(xué)性能、細(xì)胞間連接以及細(xì)胞基質(zhì),大大提高了細(xì)胞移植的成活率。因此,本課題設(shè)計(jì)一個(gè)單中心、前瞻性、連續(xù)性隨機(jī)臨床對(duì)照試驗(yàn)研究,初步評(píng)估應(yīng)用自體PDLSC膜片復(fù)合目前臨床常用的骨材料(Bio-Oss~?)治療牙周骨下袋缺損的安全性和有效性。由于現(xiàn)階段還處在干細(xì)胞牙周治療的初級(jí)階段,本試驗(yàn)的主要目的是評(píng)價(jià)干細(xì)胞用于牙科領(lǐng)域的安全性。自體PDLSCs來(lái)源于患者自體牙周膜組織,由于牙周炎的患者多為中老年人,所以在完成臨床試驗(yàn)期間,我們對(duì)來(lái)源于42個(gè)個(gè)體的62顆牙齒來(lái)源的干細(xì)胞,按照年齡進(jìn)行分組,對(duì)比分析不同年齡組個(gè)體來(lái)源的PDLSCs及其細(xì)胞膜片的生物學(xué)特征和再生潛能,探索年齡因素對(duì)PDLSCs及其細(xì)胞膜片的影響,為進(jìn)一步大樣本、多中心臨床試驗(yàn)的開(kāi)展提供參考和借鑒。方法1.制定符合臨床試驗(yàn)的自體牙周膜干細(xì)胞膜片制備和運(yùn)送流程:拔除患者無(wú)保留價(jià)值的牙齒,運(yùn)送到具有臨床細(xì)胞培養(yǎng)資格的實(shí)驗(yàn)室,從牙根表面中1/3分離殘留牙周膜組織,按照制定的標(biāo)準(zhǔn)程序,分離、純化、培養(yǎng)PDLSCs并制備PDLSC膜片,按照規(guī)定流程和條件,運(yùn)送至臨床試驗(yàn)管理護(hù)士,備用。2.制定《自體牙周膜干細(xì)胞復(fù)合煅燒骨修復(fù)牙周炎所致骨下袋牙周缺損的臨床研究》臨床研究方案,通過(guò)第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn),納入患者按照牙齒隨機(jī)分組原則分為對(duì)照組(GTR手術(shù)配合Bio-oss骨粉植入)和細(xì)胞組(GTR手術(shù)配合PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入),歷經(jīng)12個(gè)月的隨訪,根據(jù)不良事件發(fā)生的頻率和程度評(píng)價(jià)干細(xì)胞牙周治療的安全性,根據(jù)牙周手術(shù)后3個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月骨再生情況及其相關(guān)臨床指標(biāo)評(píng)價(jià)有效性。3.收集臨床因阻生、無(wú)無(wú)功能等原因拔除的第三磨牙,根據(jù)供體年齡,將牙齒分為A(18-30歲)、B(31-45歲)、C(46-62歲)三組,按照臨床試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),分離培養(yǎng)PDLSCs。在細(xì)胞水平,通過(guò)CFU-F測(cè)定、MTT實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)、細(xì)胞成骨、成脂分化能力、衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(SA-βG)染色、細(xì)胞多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)等方法評(píng)估不同年齡組PDLSCs的生物學(xué)活性。在細(xì)胞膜片水平,通過(guò)細(xì)胞膜片形態(tài)表征、ALP活性測(cè)定、蛋白形成能力和成骨基因表達(dá)分析等方法,評(píng)估細(xì)胞膜片再生潛能。本實(shí)驗(yàn)不僅為臨床試驗(yàn)結(jié)果的分析、評(píng)價(jià)提供細(xì)胞層面的參考,也為進(jìn)一步設(shè)計(jì)大規(guī)模、多中心同類試驗(yàn)提供重要數(shù)據(jù)資料。結(jié)果1.臨床試驗(yàn)中心提供的24顆牙齒,除2顆沒(méi)能正常獲得可供膜片制備的PDLSCs外,其余牙齒均獲得滿足臨床使用要求的細(xì)胞膜片。膜片制備、轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中,無(wú)意外或影響細(xì)胞安全的事件發(fā)生。2.本實(shí)驗(yàn)共有30位牙周炎患者、48顆骨下袋缺損的牙齒符合納入和排除標(biāo)準(zhǔn),年齡分布從18至65歲。48顆牙齒隨機(jī)分成對(duì)照組和細(xì)胞組,排除骨缺損不合要求、細(xì)胞培養(yǎng)失敗等原因,最后對(duì)照組21顆牙齒成功接受GTR+Bio-oss骨粉植入治療,實(shí)驗(yàn)組20顆牙齒成功接受GTR+PDLSC膜片+Bio-oss骨粉植入治療。隨訪期間,安全性評(píng)估未發(fā)現(xiàn)因PDLSCs植入引起的任何不良事件。有效性評(píng)估結(jié)果顯示,兩組患牙治療后3月、6月和12月,牙槽骨的高度在骨下袋缺損處均有明顯增加,且隨時(shí)間延長(zhǎng),骨缺損面積縮小,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001)。但對(duì)照組和細(xì)胞組兩組間比較,差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P(29)0.05)。3.從不同年齡組供體獲得的PDLSCs,增殖潛能、成骨分化潛能以及多能性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)均隨年齡增加而呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。此外,SA-βG染色結(jié)果顯示PDLSCs隨著年齡增加,細(xì)胞SA-βG陽(yáng)性率增加。通過(guò)電鏡掃描和Ki-67免疫組化染色顯示,年老PDLSCs形成細(xì)胞膜片的能力較年輕PDLSCs減弱。根據(jù)細(xì)胞膜片ECM蛋白含量(包括纖連蛋白、整聯(lián)蛋白β1和COL-I)和ALP活性測(cè)定,成骨相關(guān)基因檢測(cè)(ALP、Runx2和骨鈣素)等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),來(lái)源于老年P(guān)DLSCs的細(xì)胞膜片的成骨潛能弱于年輕組PDLSCs誘導(dǎo)的細(xì)胞膜片。結(jié)論1.從臨床拔除患牙中獲取人PDLSCs,方法可靠、技術(shù)成熟。本實(shí)驗(yàn)建立的臨床人PDLSC膜片的制備和轉(zhuǎn)運(yùn)標(biāo)準(zhǔn)可以在同類試驗(yàn)中推廣。2.自體PDLSCs治療牙周炎所致骨下袋缺損,切實(shí)可行、安全可靠。雖然本試驗(yàn)結(jié)果并沒(méi)有顯示細(xì)胞治療組獲得更多的牙周組織再生,但病例數(shù)少、年齡因素對(duì)細(xì)胞膜片再生潛能的差異、細(xì)胞載體材料Bio-Oss的細(xì)胞相容性問(wèn)題,可能對(duì)本試驗(yàn)的結(jié)果會(huì)產(chǎn)生干擾。自體PDLSCs治療牙周炎所致骨下袋缺損的有效性需要進(jìn)一步多中心、大規(guī)模的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。3.年齡因素對(duì)自體PDLSCs和自體PDLSC膜片的生物學(xué)性能產(chǎn)生重要影響,進(jìn)一步類似臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)中,必需加以考慮。4.口腔疾病防治領(lǐng)域是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的沃土,病員豐富、臨床需求廣泛。牙周病防治是一個(gè)嚴(yán)峻的社會(huì)問(wèn)題,在發(fā)展中國(guó)家尤為突出;迄今為止,臨床上缺乏有效的防治措施。如何盡早引入轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)理念,立足臨床疾病治療,將實(shí)驗(yàn)室新發(fā)現(xiàn)、新成果轉(zhuǎn)化并用于疾病治療,是牙周炎診療水平全面整體提升的關(guān)鍵舉措。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R781.4
【圖文】：

20 世紀(jì)以來(lái)，隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展和牙周膜干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，如何利用組織工程原理和技術(shù)、通過(guò)體外培養(yǎng)干細(xì)胞促進(jìn)牙周支持組織再生，成為口腔醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱門(mén)課題，也必將對(duì)牙周炎的臨床治療將產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[6]。同時(shí)，牙周組織涉及牙槽骨（alveolar bone）、牙周韌帶（periodontal ligament）和牙骨質(zhì)（cementum）三種完全不同的組織，這些組織形成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能（骨-牙周膜-牙骨質(zhì)），因此牙周組織再生可以作為機(jī)體復(fù)雜組織器官再生的 模型 （圖 1）。由此可見(jiàn)，牙周再生策略和機(jī)理研究的意義，未來(lái)可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)牙周疾病治療本身[4]。研究表明，國(guó)內(nèi)外研究者主要將干細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增后通過(guò)一定技術(shù)將干細(xì)胞移植至損傷區(qū)域的方法，以達(dá)到牙周組織再生的目的，然而，高標(biāo)準(zhǔn)的干細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)、嚴(yán)格的體外調(diào)控措施和復(fù)雜的移植技術(shù)使牙周再生技術(shù)的臨床轉(zhuǎn)化面臨大量人力、物力和財(cái)力等多方面的挑戰(zhàn)，特別是針對(duì)牙周炎等非致死性疾病的治療，高投入、高風(fēng)險(xiǎn)和低回報(bào)成為橫跨在基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用之間的巨大鴻溝[18]。

空軍軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文問(wèn)題。雖然目前已有干細(xì)胞牙周治療的嘗試，其臨床安全性、有效性還缺乏嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)的臨床對(duì)照試驗(yàn)來(lái)證實(shí)[11,14,15]�？傊谌齻�(gè)階段治療方法以有效的牙周基礎(chǔ)治療為基礎(chǔ)，在 GTR\GBR 大量臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的方法和手段，把現(xiàn)有干細(xì)胞生物學(xué)研究的最新成果盡快推進(jìn)到臨床疾病治療，具有重要意義和深遠(yuǎn)影響，不僅對(duì)牙周病臨床治療帶來(lái)新的機(jī)遇，也為再生牙科學(xué)其它領(lǐng)域的研究提供參考和借鑒[26-28]。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 王方;謝誠(chéng);吳國(guó)鋒;趙銥民;;組織工程牙周膜細(xì)胞片的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2011年02期

2 蔣學(xué)武;;哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)實(shí)踐的啟示[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2010年22期

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本文編號(hào)：2716903