【摘要】： 背景： 正畸治療過程中機(jī)械力作用于牙齒,使牙周組織所處的力學(xué)環(huán)境發(fā)生改變,牙周膜內(nèi)的細(xì)胞對牙周膜的應(yīng)力與應(yīng)變做出應(yīng)激反應(yīng),并發(fā)生形態(tài)和功能的改變,進(jìn)而使牙周組織發(fā)生改建,達(dá)到牙齒移動的目的。 牙周膜微血管系統(tǒng)是牙周膜的重要組成部分,對于維持牙齒及牙周組織的生理功能具有重要作用。血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)是血管壁的主要組成細(xì)胞,在正畸治療中受到血液流動產(chǎn)生的切應(yīng)力,周期性張應(yīng)力等力學(xué)因素的作用,是一種對應(yīng)力敏感的細(xì)胞。有研究表明,在適宜的周期性應(yīng)力作用下,血管平滑肌細(xì)胞可以發(fā)生增殖、分化和遷移,進(jìn)而使牙周膜發(fā)生適應(yīng)性改建。然而,力學(xué)信號如何被血管平滑肌細(xì)胞感知,從而轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號來調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的增殖、分化和遷移,目前還缺乏深入研究。 絲裂素活化蛋白激酶(MAPK)是近代發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞增殖有關(guān)的胞內(nèi)關(guān)鍵酶,是多種生長因子、細(xì)胞因子、血管活性肽參與VSMC的增殖過程的共同通道。p38蛋白激酶(P38 MAPK)是MAPK家族的最新成員,參與了多種細(xì)胞的胞內(nèi)信號傳遞。P38在介導(dǎo)炎癥、應(yīng)激等多種細(xì)胞反應(yīng)中起著重要作用,還參與細(xì)胞的存活、分化和發(fā)育的過程,是近年來信號傳導(dǎo)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。目前,關(guān)于張應(yīng)力作用下p38是否參與了血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)和具體調(diào)節(jié)機(jī)制還不是很清楚。 目的： 構(gòu)建血管平滑肌細(xì)胞體外培養(yǎng)——力學(xué)刺激模型,從細(xì)胞及分子水平闡明周期性張應(yīng)力對血管平滑肌細(xì)胞增殖的影響；通過阻斷p38 MAPK信號通路,闡明p38 MAPK在應(yīng)力介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用,并明確周期性張應(yīng)力、p38 MAPK信號通路、血管平滑肌細(xì)胞增殖三者的關(guān)系；揭示正畸力作用下,牙周膜適應(yīng)性改建的細(xì)胞及分子機(jī)制,并為臨床醫(yī)生采用不同的手段和方法調(diào)控血管改建,進(jìn)行臨床干預(yù)提供理論基礎(chǔ)。 方法： 以體外培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象。實(shí)驗(yàn)分為對照組(0h加力組),6h加力組,12h加力組和24h加力組。細(xì)胞所受力值大小以培養(yǎng)皿底部硅膠膜拉伸應(yīng)變率(%)表示,拉伸率越大,表示細(xì)胞所受張力越大。加力組細(xì)胞的力值定為10%,頻率為1HZ,即6循環(huán)／分鐘,每一循環(huán)包括5秒牽張和5秒松弛。通過MTT檢測細(xì)胞的增殖活性；流式細(xì)胞術(shù)檢測處于增殖周期中的細(xì)胞比率；RT-PCR來檢測CDK2的表達(dá)。用western blotting來檢測不同實(shí)驗(yàn)組中磷酸化p38 MAPK的表達(dá)變化。另外,我們用p38 MAPK的特異性抑制劑SB203580處理血管平滑肌細(xì)胞一小時后再對細(xì)胞施加相同的張應(yīng)力,其后用同樣的方法檢測細(xì)胞增殖的變化以及磷酸化p38 MAPK表達(dá)的變化。應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件包對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.MTT結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)施加的10%,1HZ的周期性張應(yīng)力可以促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。另外,血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力隨著加力時間的延長而加強(qiáng),到12小時達(dá)到最高峰,之后增殖能力開始下降但是仍然高于未加力組。 2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示周期性張應(yīng)力作用后,處于S期的血管平滑肌細(xì)胞的比率升高,隨著加力時間的延長,處于S期的細(xì)胞的比率也隨之增高。相對于未加力組,12h組處于S期的細(xì)胞比率最高。 3.RT-PCR結(jié)果顯示,加力后CDK2基因的表達(dá)也出現(xiàn)升高趨勢,也是在12h時達(dá)到最高,之后開始下降,但是仍然高于未加力組。 4. Western blotting結(jié)果顯示磷酸化p38 MAPK在各組中均有表達(dá)。隨著加力時間的延長,磷酸化P38 MAPK的表達(dá)也增強(qiáng),并在加力12小時后達(dá)到高峰。之后磷酸化P38 MAPK的表達(dá)開始下降,但仍高于未加力組。 5. Western blotting結(jié)果顯示用SB203580處理細(xì)胞并對細(xì)胞施加周期性張應(yīng)力后,磷酸化P38 MAPK的表達(dá)出現(xiàn)明顯的下降。另外,MTT結(jié)果顯示相對于為加抑制劑組,加入抑制劑后細(xì)胞的增殖活性出現(xiàn)明顯下降。RT-PCR結(jié)果顯示相對于未加抑制劑組,CDK2的表達(dá)量也出現(xiàn)了降低,但是仍然高于未加力組。 結(jié)論： 1.大小為10%,頻率為1HZ的周期性張應(yīng)力會誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞的增殖。 2.血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力在一定的時間范圍內(nèi)跟周期性張應(yīng)力的作用時間成正比,在本實(shí)驗(yàn)中,周期性張應(yīng)力作用12h后血管平滑肌細(xì)胞的增殖活性最強(qiáng)。 3.周期性張應(yīng)力作用下,磷酸化p38 MAPK蛋白的表達(dá)水平變化與血管平滑肌細(xì)胞增殖能力的變化趨勢一致,而抑制P38 MAPK的活化導(dǎo)致了細(xì)胞增殖水平的下降,因而提示p38 MAPK信號通路是參與調(diào)控張應(yīng)力誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖的重要通路之一
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R783.5

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