【摘要】： 近年來(lái),研究者發(fā)現(xiàn)人牙周膜細(xì)胞群(human periodontal ligament cell population, HPDLP)是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性細(xì)胞群,含有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞及未分化的前體干細(xì)胞等多種細(xì)胞成分,具有合成新生牙骨質(zhì)、牙周纖維、牙槽骨等的牙周組織功能。這些細(xì)胞亞型可處于不同的分化階段或具有不定向的分化趨勢(shì),牙周組織再生修復(fù)與牙周膜細(xì)胞的異質(zhì)性有密切關(guān)系。牙根發(fā)育早期,牙囊細(xì)胞、上皮根鞘和牙乳頭細(xì)胞相互作用,形成了牙根牙周組織。經(jīng)典理論認(rèn)為,牙周前體細(xì)胞—牙囊細(xì)胞穿透斷裂的上皮根鞘與牙根接觸并相互作用,分化成為成牙骨質(zhì)細(xì)胞并形成牙骨質(zhì)。在臨床實(shí)際操作中,牙周炎患牙的牙周潔治與根面平整,以及局部的抗炎處理是促進(jìn)牙周再生的前提。通過(guò)物理或化學(xué)的方法進(jìn)行牙根表面處理,其目的是為了去除牙根表層的玷污層,改善根面周圍的局部微環(huán)境,暴露新鮮的牙骨質(zhì)或牙本質(zhì),增加局部的趨化刺激因子,以此來(lái)誘導(dǎo)牙周細(xì)胞的牙根表面貼附性,促進(jìn)牙周再生。 研究證明釉基質(zhì)蛋白衍生物(Enamel Matrix Derivatives, EMD,商品名為Emdogain)在體外可以促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞(Periodontal ligament cells, PDLC)的黏附、伸展,并且促進(jìn)其分泌生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子,其生物學(xué)行為類似一種多功能的生長(zhǎng)因子。EMD還能誘導(dǎo)多能干細(xì)胞系細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化,并能促進(jìn)成骨細(xì)胞系的增殖和分化。將EMD與牙周組織再生(Guided tissue regeneration,GTR)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)在牙周缺損部位的牙根表面有新的無(wú)細(xì)胞牙骨質(zhì)生成,并有成束的膠原纖維埋入其中,恢復(fù)了原有牙周膜的解剖結(jié)構(gòu),提示EMD可促進(jìn)牙周的完全再生。由于牙周再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是牙骨質(zhì)的再生,而牙骨質(zhì)形成細(xì)胞的存在和功能性活動(dòng)則是牙周修復(fù)再生的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。牙齒發(fā)育期的Hertwig's上皮根鞘的內(nèi)層細(xì)胞分泌的釉基質(zhì)蛋白,具有促進(jìn)牙周膜再生和參與無(wú)細(xì)胞牙骨質(zhì)形成的過(guò)程�；谶@種理論,EMD很可能是一種在牙周再生過(guò)程中,通過(guò)刺激PDLC增生、并可能誘導(dǎo)PDLC向成牙骨質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞分化的基質(zhì)蛋白。因此認(rèn)為EMD對(duì)人牙周膜細(xì)胞群向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化有重要作用。 在牙周組織再生中最困難的是牙骨質(zhì)的再生,目前也是對(duì)其了解最少的牙周組織。雖然眾多的體內(nèi)外研究表明,通過(guò)物理、化學(xué)因素的處理,可以促進(jìn)牙周組織的再生,包括牙骨質(zhì)的再生。但對(duì)于形成牙骨質(zhì)的前體細(xì)胞即成牙骨質(zhì)細(xì)胞如何從HPDLP分化而來(lái)及其機(jī)制是什么?仍然還不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)擬探討HPDLP經(jīng)EMD誘導(dǎo)后能否向成牙骨質(zhì)細(xì)胞方向分化及其可能的誘導(dǎo)機(jī)制,為進(jìn)一步了解HPDLP的定向分化潛能及牙周組織再生奠定基礎(chǔ)。 第一章HPDLP的分離培養(yǎng)和鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)HPDLP,并進(jìn)行鑒定。 方法： 1.分離培養(yǎng)HPDLP收集臨床因正畸需要拔除的牙周健康、無(wú)齲的新鮮前磨牙,刮下根中1／3牙周膜組織,采用組織塊法培養(yǎng)。 2.HPDLP的初步鑒定通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá),對(duì)細(xì)胞來(lái)源進(jìn)行初步鑒定。 結(jié)果： 1.形態(tài)學(xué)特征：3—6天見多個(gè)組織塊邊緣有細(xì)胞開始游出,細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差別,大多數(shù)為長(zhǎng)梭形。少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形,體積較小,胞體豐滿,生長(zhǎng)較快,約7—14天開始匯合,以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長(zhǎng)。 2.免疫組織化學(xué)特征：免疫組化顯示波形絲蛋白染色細(xì)胞胞漿可見黃色顆粒,角蛋白染色細(xì)胞胞漿未見黃色顆粒。表明細(xì)胞較為單一,屬于中胚層來(lái)源細(xì)胞,且無(wú)上皮細(xì)胞的污染,證實(shí)所分離培養(yǎng)的是HPDLP,可用于進(jìn)一步的研究。 第二章EMD誘導(dǎo)后HPDLP形態(tài)觀察及在牙骨質(zhì)片上的貼附、增殖情況 目的：觀察HPDLP在EMD誘導(dǎo)下向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的潛能,為HPDLP在牙周組織再生中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法： 1.將HPDLP體外EMD誘導(dǎo)7天,制成細(xì)胞爬片,HE染色觀察細(xì)胞形態(tài).以未加EMD為對(duì)照組。 2.制備牙骨質(zhì)片,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組牙骨質(zhì)片經(jīng)EMD包被24小時(shí),接種經(jīng)EMD誘導(dǎo)的細(xì)胞,對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組平行處理,只是細(xì)胞及牙骨質(zhì)片不經(jīng)EMD處理。誘導(dǎo)7天后,常規(guī)生物樣本制備,掃描電鏡觀察牙骨質(zhì)片上的細(xì)胞數(shù)量及形態(tài)。 3.用MTT法分別檢查HPDLP在牙骨質(zhì)片上的附著(16小時(shí))和增殖(72小時(shí))情況,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。 結(jié)果 1.HPDLP經(jīng)EMD體外誘導(dǎo)后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,由梭形的成纖維樣細(xì)胞變?yōu)槎嘟切蔚念惓裳拦琴|(zhì)樣細(xì)胞。 2.掃描電鏡觀察細(xì)胞在牙骨質(zhì)片上的形態(tài)：對(duì)照組細(xì)胞細(xì)長(zhǎng)、紡錘形或梭形外形,呈典型的成纖維細(xì)胞形狀,細(xì)胞表面有許多微絨毛。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞呈多角形或立方形的類成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞,表面微絨毛明顯減少,并可見細(xì)胞突起與鄰近細(xì)胞相連,細(xì)胞表面可見大量的細(xì)胞外分泌基質(zhì)。誘導(dǎo)組貼附細(xì)胞數(shù)比非誘導(dǎo)組明顯增多。 3.MTT法檢測(cè)顯示：HPDLP經(jīng)EMD作用后細(xì)胞在牙骨質(zhì)片上的附著、增殖能力明顯增強(qiáng),與對(duì)照組相比,具有顯著性差異(貼附：t=-3.318,p=0.008；增值：t=-6.499,p=0.000)。 第三章EMD誘導(dǎo)后HPDLP內(nèi)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白的表達(dá) 目的： 旨在了解體外培養(yǎng)環(huán)境中HPDLP在EMD誘導(dǎo)下,成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白的表達(dá),探索人牙周膜細(xì)胞群向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的機(jī)制。 方法： EMD作用HPDLP,分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色在蛋白水平進(jìn)行半定量檢測(cè)成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白的表達(dá),包括堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen,COLⅠ)表達(dá)；通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)兩組HPDLP中成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示：EMD誘導(dǎo)7天：ALP、BSP、COLⅠ、OCN實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組均有表達(dá)；光密度值測(cè)量顯示：EMD誘導(dǎo)7天ALP、BSP、COLⅠ實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間具有顯著性差異(ALP:t=12.731,p=0.000; BSP:t=5.123,p=0.000;COLⅠ:t=-2.859,p=0.010), OCN實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異(t=0.757,p=0.459)。 2.實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)檢測(cè)結(jié)果：EMD誘導(dǎo)7天,實(shí)驗(yàn)組ALP、COLⅠ的表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高,分別是6.01倍、4.35倍；而OCN表達(dá)量無(wú)明顯升高,實(shí)驗(yàn)組是對(duì)照組的1.25倍。 全文結(jié)論： 1.HPDLP經(jīng)EMD誘導(dǎo)后在牙骨質(zhì)片上的貼附、增殖能力增強(qiáng)并向類成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞方向分化。 2.EMD誘導(dǎo)后HPDLP細(xì)胞內(nèi)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化相關(guān)蛋白的表達(dá)增強(qiáng),可能是HPDLP向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)的機(jī)制之一。 3.HPDLP在EMD誘導(dǎo)下向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的潛能明顯增強(qiáng)。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R780.2
【圖文】：

Fig.l一 1A.Primaryeulturefor3days， CellSelimbingfromtiSSueS(x100)圖1一IB原代8天組織塊周圍細(xì)胞放射狀生長(zhǎng) (LMX100倍)Fig.1一 ZBPrimaryeulturefor8days，eells growinginradialSurroundingtiSSues(xl00)

圖1一IC原代12天，細(xì)胞生長(zhǎng)致密 (LMX100倍)圖1一ID傳代5天，細(xì)胞呈螺旋式生長(zhǎng) (LMX100倍)Fig.1一 ICPrimaryeulturefor8days， eellsgrowingdensely(x100)Fig.1一 4DSubeultureeellss growinginspiral一type(LMdays，eellsX100)2.1細(xì)胞來(lái)源及表型鑒定免疫組化顯示細(xì)胞波形絲蛋白染色陽(yáng)性(胞漿內(nèi)可見黃色顆粒著色)，角蛋白染色陰性(胞漿內(nèi)無(wú)黃色顆粒著色)。表明細(xì)胞較為單一，屬于間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞，且無(wú)上皮細(xì)胞的污染。陰性對(duì)照均不著色(圖1一ZA一圖l一ZC)。圖1一ZA抗波形絲蛋白陽(yáng)性(胞漿內(nèi)可見黃色顆粒著色 LMx400倍)Fig

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2713751