【摘要】： 近年來,研究者發(fā)現(xiàn)人牙周膜細胞群(human periodontal ligament cell population, HPDLP)是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性細胞群,含有成纖維細胞、成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞及未分化的前體干細胞等多種細胞成分,具有合成新生牙骨質(zhì)、牙周纖維、牙槽骨等的牙周組織功能。這些細胞亞型可處于不同的分化階段或具有不定向的分化趨勢,牙周組織再生修復與牙周膜細胞的異質(zhì)性有密切關(guān)系。牙根發(fā)育早期,牙囊細胞、上皮根鞘和牙乳頭細胞相互作用,形成了牙根牙周組織。經(jīng)典理論認為,牙周前體細胞—牙囊細胞穿透斷裂的上皮根鞘與牙根接觸并相互作用,分化成為成牙骨質(zhì)細胞并形成牙骨質(zhì)。在臨床實際操作中,牙周炎患牙的牙周潔治與根面平整,以及局部的抗炎處理是促進牙周再生的前提。通過物理或化學的方法進行牙根表面處理,其目的是為了去除牙根表層的玷污層,改善根面周圍的局部微環(huán)境,暴露新鮮的牙骨質(zhì)或牙本質(zhì),增加局部的趨化刺激因子,以此來誘導牙周細胞的牙根表面貼附性,促進牙周再生。 研究證明釉基質(zhì)蛋白衍生物(Enamel Matrix Derivatives, EMD,商品名為Emdogain)在體外可以促進牙周韌帶細胞(Periodontal ligament cells, PDLC)的黏附、伸展,并且促進其分泌生長因子和細胞因子,其生物學行為類似一種多功能的生長因子。EMD還能誘導多能干細胞系細胞向成骨細胞轉(zhuǎn)化,并能促進成骨細胞系的增殖和分化。將EMD與牙周組織再生(Guided tissue regeneration,GTR)技術(shù)結(jié)合應(yīng)用,發(fā)現(xiàn)在牙周缺損部位的牙根表面有新的無細胞牙骨質(zhì)生成,并有成束的膠原纖維埋入其中,恢復了原有牙周膜的解剖結(jié)構(gòu),提示EMD可促進牙周的完全再生。由于牙周再生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是牙骨質(zhì)的再生,而牙骨質(zhì)形成細胞的存在和功能性活動則是牙周修復再生的細胞學基礎(chǔ)。牙齒發(fā)育期的Hertwig's上皮根鞘的內(nèi)層細胞分泌的釉基質(zhì)蛋白,具有促進牙周膜再生和參與無細胞牙骨質(zhì)形成的過程�；谶@種理論,EMD很可能是一種在牙周再生過程中,通過刺激PDLC增生、并可能誘導PDLC向成牙骨質(zhì)細胞或成骨細胞分化的基質(zhì)蛋白。因此認為EMD對人牙周膜細胞群向成牙骨質(zhì)細胞方向分化有重要作用。 在牙周組織再生中最困難的是牙骨質(zhì)的再生,目前也是對其了解最少的牙周組織。雖然眾多的體內(nèi)外研究表明,通過物理、化學因素的處理,可以促進牙周組織的再生,包括牙骨質(zhì)的再生。但對于形成牙骨質(zhì)的前體細胞即成牙骨質(zhì)細胞如何從HPDLP分化而來及其機制是什么?仍然還不清楚。因此,本實驗擬探討HPDLP經(jīng)EMD誘導后能否向成牙骨質(zhì)細胞方向分化及其可能的誘導機制,為進一步了解HPDLP的定向分化潛能及牙周組織再生奠定基礎(chǔ)。 第一章HPDLP的分離培養(yǎng)和鑒定 目的：體外分離培養(yǎng)HPDLP,并進行鑒定。 方法： 1.分離培養(yǎng)HPDLP收集臨床因正畸需要拔除的牙周健康、無齲的新鮮前磨牙,刮下根中1／3牙周膜組織,采用組織塊法培養(yǎng)。 2.HPDLP的初步鑒定通過免疫細胞化學方法檢測培養(yǎng)細胞的波形絲蛋白和角蛋白的表達,對細胞來源進行初步鑒定。 結(jié)果： 1.形態(tài)學特征：3—6天見多個組織塊邊緣有細胞開始游出,細胞形態(tài)無明顯差別,大多數(shù)為長梭形。少數(shù)為多角形、紡錘狀或橢圓形,體積較小,胞體豐滿,生長較快,約7—14天開始匯合,以組織塊為中心成放射狀、漩渦狀生長。 2.免疫組織化學特征：免疫組化顯示波形絲蛋白染色細胞胞漿可見黃色顆粒,角蛋白染色細胞胞漿未見黃色顆粒。表明細胞較為單一,屬于中胚層來源細胞,且無上皮細胞的污染,證實所分離培養(yǎng)的是HPDLP,可用于進一步的研究。 第二章EMD誘導后HPDLP形態(tài)觀察及在牙骨質(zhì)片上的貼附、增殖情況 目的：觀察HPDLP在EMD誘導下向成牙骨質(zhì)細胞分化的潛能,為HPDLP在牙周組織再生中的作用提供實驗基礎(chǔ)。 方法： 1.將HPDLP體外EMD誘導7天,制成細胞爬片,HE染色觀察細胞形態(tài).以未加EMD為對照組。 2.制備牙骨質(zhì)片,分為實驗組和對照組,實驗組牙骨質(zhì)片經(jīng)EMD包被24小時,接種經(jīng)EMD誘導的細胞,對照組與實驗組平行處理,只是細胞及牙骨質(zhì)片不經(jīng)EMD處理。誘導7天后,常規(guī)生物樣本制備,掃描電鏡觀察牙骨質(zhì)片上的細胞數(shù)量及形態(tài)。 3.用MTT法分別檢查HPDLP在牙骨質(zhì)片上的附著(16小時)和增殖(72小時)情況,分為實驗組和對照組。 結(jié)果 1.HPDLP經(jīng)EMD體外誘導后,細胞形態(tài)發(fā)生了明顯改變,由梭形的成纖維樣細胞變?yōu)槎嘟切蔚念惓裳拦琴|(zhì)樣細胞。 2.掃描電鏡觀察細胞在牙骨質(zhì)片上的形態(tài)：對照組細胞細長、紡錘形或梭形外形,呈典型的成纖維細胞形狀,細胞表面有許多微絨毛。實驗組細胞呈多角形或立方形的類成牙骨質(zhì)樣細胞,表面微絨毛明顯減少,并可見細胞突起與鄰近細胞相連,細胞表面可見大量的細胞外分泌基質(zhì)。誘導組貼附細胞數(shù)比非誘導組明顯增多。 3.MTT法檢測顯示：HPDLP經(jīng)EMD作用后細胞在牙骨質(zhì)片上的附著、增殖能力明顯增強,與對照組相比,具有顯著性差異(貼附：t=-3.318,p=0.008；增值：t=-6.499,p=0.000)。 第三章EMD誘導后HPDLP內(nèi)成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)蛋白的表達 目的： 旨在了解體外培養(yǎng)環(huán)境中HPDLP在EMD誘導下,成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)蛋白的表達,探索人牙周膜細胞群向成牙骨質(zhì)細胞分化誘導的機制。 方法： EMD作用HPDLP,分為對照組和實驗組。采用免疫細胞化學染色在蛋白水平進行半定量檢測成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)蛋白的表達,包括堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、Ⅰ型膠原蛋白(typeⅠcollagen,COLⅠ)表達；通過實時定量PCR(RT-PCR)在轉(zhuǎn)錄水平檢測兩組HPDLP中成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)蛋白的表達。 結(jié)果： 1.免疫細胞化學染色顯示：EMD誘導7天：ALP、BSP、COLⅠ、OCN實驗組、對照組均有表達；光密度值測量顯示：EMD誘導7天ALP、BSP、COLⅠ實驗組與對照組之間具有顯著性差異(ALP:t=12.731,p=0.000; BSP:t=5.123,p=0.000;COLⅠ:t=-2.859,p=0.010), OCN實驗組與對照組之間無顯著性差異(t=0.757,p=0.459)。 2.實時定量PCR (RT-PCR)檢測結(jié)果：EMD誘導7天,實驗組ALP、COLⅠ的表達量較對照組明顯升高,分別是6.01倍、4.35倍；而OCN表達量無明顯升高,實驗組是對照組的1.25倍。 全文結(jié)論： 1.HPDLP經(jīng)EMD誘導后在牙骨質(zhì)片上的貼附、增殖能力增強并向類成牙骨質(zhì)樣細胞方向分化。 2.EMD誘導后HPDLP細胞內(nèi)的成牙骨質(zhì)細胞礦化相關(guān)蛋白的表達增強,可能是HPDLP向成牙骨質(zhì)細胞分化誘導的機制之一。 3.HPDLP在EMD誘導下向成牙骨質(zhì)細胞分化的潛能明顯增強。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R780.2
【圖文】：

Fig.l一 1A.Primaryeulturefor3days， CellSelimbingfromtiSSueS(x100)圖1一IB原代8天組織塊周圍細胞放射狀生長 (LMX100倍)Fig.1一 ZBPrimaryeulturefor8days，eells growinginradialSurroundingtiSSues(xl00)

圖1一IC原代12天，細胞生長致密 (LMX100倍)圖1一ID傳代5天，細胞呈螺旋式生長 (LMX100倍)Fig.1一 ICPrimaryeulturefor8days， eellsgrowingdensely(x100)Fig.1一 4DSubeultureeellss growinginspiral一type(LMdays，eellsX100)2.1細胞來源及表型鑒定免疫組化顯示細胞波形絲蛋白染色陽性(胞漿內(nèi)可見黃色顆粒著色)，角蛋白染色陰性(胞漿內(nèi)無黃色顆粒著色)。表明細胞較為單一，屬于間充質(zhì)來源細胞，且無上皮細胞的污染。陰性對照均不著色(圖1一ZA一圖l一ZC)。圖1一ZA抗波形絲蛋白陽性(胞漿內(nèi)可見黃色顆粒著色 LMx400倍)Fig

【參考文獻】

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本文編號：2713751