發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 18:04

【摘要】：臨床實(shí)踐表明：口腔頜面部惡性腫瘤(鼻咽癌、口腔癌和咽喉癌)患者，經(jīng)放射治療后，往往損傷唾液腺導(dǎo)致進(jìn)行性唾液分泌減少，出現(xiàn)口干癥狀，其臨床表現(xiàn)與干燥綜合征(Sjogren‘s syndrome,SS)十分類似。干燥綜合征(SS)是一類慢性自身免疫性疾病。病因?qū)W研究發(fā)現(xiàn)：水通道蛋白5(AQP5)的合成和表達(dá)異常與SS的發(fā)病密切相關(guān),其表達(dá)降低是導(dǎo)致SS唾液分泌異常的重要原因。有研究表明：DNA甲基化參與了AQP5表達(dá)調(diào)控，是AQP5基因表達(dá)受抑的重要機(jī)制。去甲基化酶(MBD2)是DNA甲基化的重要組成部分。具有甲基化沉默能力的基因,又具去甲基化酶活性的DNA甲基化調(diào)控蛋白,在多種腫瘤的表觀遺傳學(xué)調(diào)控中扮演著重要角色。經(jīng)生物學(xué)軟件測(cè)試分析，作為甲基化體系中的重要組成部分，去甲基化酶MBD2(methyl-CpG binding domain2)可以調(diào)控AQP5甲基化狀態(tài)，但參與AQP5表達(dá)調(diào)控及其機(jī)制尚不清楚。 目的：為驗(yàn)證MBD2與AQP5的分子調(diào)控關(guān)系。建立輻射致傷頜下腺細(xì)胞(humansubmandibular gland，HSG)模型，通過(guò)MBD2調(diào)控途徑，定向控制和調(diào)高AQP5的合成與表達(dá)，初步探討MBD2在AQP5表達(dá)調(diào)控中的相互作用及調(diào)控機(jī)理，為干燥綜合征的臨床治療提供新的視角。 方法：在前期AQP5和SS相關(guān)研究及生物信息學(xué)測(cè)試分析的基礎(chǔ)上，本課題在分子、細(xì)胞的層次研究二者關(guān)系。首先，通過(guò)構(gòu)建電離輻射致傷人頜下腺(humansubmandibular gland，HSG)細(xì)胞模型。利用免疫熒光、RT-PCR、western-blot的方法檢測(cè)HSG細(xì)胞系在輻射前后AQP5的差異表達(dá)。然后，通過(guò)構(gòu)建MBD2腺病毒過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染到HSG細(xì)胞系中，為了證明MBD2對(duì)AQP5的調(diào)控關(guān)系，利用RT-PCR、western-blot的方法驗(yàn)證AQP5的表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：1、成功構(gòu)建電離輻射致傷人頜下腺(human submandibular gland，HSG)細(xì)胞模型。2、通過(guò)RT-PCR、western-blot、免疫熒光的方法證明：AQP5在60鈷γ射線輻射后，無(wú)論是其mRNA水平，還是蛋白質(zhì)水平的表達(dá)都會(huì)被抑制。3、成功構(gòu)建MBD2的腺病毒表達(dá)載體。4、在HSG細(xì)胞系中，MBD2能夠促進(jìn)AQP5的表達(dá)。 本實(shí)驗(yàn)，，通過(guò)對(duì)HSG細(xì)胞模型的研究，以RT-PCR、免疫熒光技術(shù)、蛋白印跡技術(shù)研究AQP5在不同條件下的表達(dá)水平。初步判定MBD2與AQP5的表達(dá)關(guān)系。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，借助于雙熒光啟動(dòng)子報(bào)告系統(tǒng)、EMSA、染色質(zhì)免疫沉淀(CHIP)等方法檢測(cè)MBD2參與AQP5表達(dá)模式，深入探討MBD2在AQP5表達(dá)調(diào)控中的相互作用及調(diào)控機(jī)理，為進(jìn)一步以去甲基化角度針對(duì)AQP5展開(kāi)SS的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【圖文】：

感染 Ad/MBD2 病毒 48 h 的A 序列，而空載體感染的細(xì)胞。M 1 2鏡下，未感染 HSG 細(xì)胞不表達(dá)綠色熒光的 HSG 細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)綠色熒光蛋白(B)，B

第三軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文MBD2 重組腺病毒經(jīng) 293 細(xì)胞包裝后 8 d，倒置顯微鏡下可見(jiàn)非常明顯的，細(xì)胞變圓、腫脹、脫壁，核變大等病變。病毒細(xì)胞經(jīng) 5 輪傳代擴(kuò)增以后大量擴(kuò)增，采用倍比稀釋法測(cè)定其滴度為：1.41×1011IU/mL。重組腺病毒載體 Ad/MBD2 轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的檢測(cè)(見(jiàn)照片 4)MBD2 病毒液感染 HSG 細(xì)胞(圖 5A)，48 h 后，倒置熒光顯微鏡下見(jiàn)大部綠色熒光蛋白(圖 5B)，圖像分析法算得細(xì)胞感染率約 70%。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.8

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 莫穎倩;戴冽;李婷;鄭東輝;蘇劍華;張白玉;;抗α-胞襯蛋白抗體在干燥綜合征診斷及病情判斷中的作用[J];國(guó)際內(nèi)科學(xué)雜志;2009年01期

2 楊軍;馬龍;史文進(jìn);楊彥春;張從紀(jì);;腺病毒介導(dǎo)CTLA4Ig對(duì)舍格倫綜合征小鼠頜下腺AQP5表達(dá)的影響[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年04期

本文編號(hào)：2711542