【摘要】：目的:對體外培養(yǎng)的人牙周膜干細胞(hPDLSCs)施加適宜時間及大小的靜壓力后,通過檢測BMP9誘導(dǎo)下hPDLSCs成骨相關(guān)因子ALP、RUNX2、OCN的基因、蛋白表達量及鈣鹽結(jié)節(jié)的生成,探討B(tài)MP9對靜壓力作用下hPDLSCs成骨分化的影響。方法:1、對hPDLSCs采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)、有限稀釋法分離純化,然后對獲得的hPDLSCs進行鑒定,并為后續(xù)實驗提供實驗細胞;2、取第3代的hPDLSCs制成密度為1×10~5個/ml的細胞懸液,接種于六塊孔板內(nèi)。采用CCK-8法和流式細胞術(shù)分別檢測不同靜壓力(0、1、2、3、5g/cm~2)作用不同時間(12h、24h、72h)后hPDLSCs的增殖活性和細胞周期,然后綜合分析兩者的結(jié)果,探討利于hPDLSCs增殖的靜壓力加載的適宜力值與作用時間。3、構(gòu)建過表達BMP9的腺病毒(Ad-BMP9)載體,并檢測Ad-BMP9轉(zhuǎn)染hPDLSCs的適宜MOI值(感染復(fù)數(shù),multiplicity of infection,MOI)。隨后對Ad-BMP9轉(zhuǎn)染后的hPDLSCs施加適宜大小及時間的靜壓力,并設(shè)置病毒陰性對照組及空白對照組,分別采用RT-qPCR和Western Blot檢測各細胞組成骨相關(guān)因子ALP、RUNX2、OCN的基因和蛋白表達,用茜素紅染色實驗檢測hPDLSCs成骨誘導(dǎo)后鈣鹽結(jié)節(jié)的生成。結(jié)果:1、對經(jīng)組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)、有限稀釋法篩選純化后得到的細胞進行鑒定,鑒定內(nèi)容包括:細胞克隆形成能力檢測、細胞周期檢測、干細胞表型及來源檢測、細胞多向分化能力檢測等,實驗結(jié)果證實本實驗所培養(yǎng)的細胞正是hPDLSCs。2、適宜大小的靜壓力(1、2、3 g/cm~2)在一定時間(12h、24h)內(nèi)加載時,hPDLSCs的OD值及PI值均增加,表明細胞的增殖活性增加;當(dāng)加力時間延長至72h,hPDLSCs的OD值及PI值均減小,表明細胞的增殖活性降低,且能在3 g/cm~2力值組觀察到細胞崩解現(xiàn)象。較大的靜壓力(5 g/cm~2)短時間(12h)加載后,hPDLSCs的OD值及PI值增加,表明細胞的增殖活性增加;但隨著加力時間的延長(24h、72h),hPDLSCs的OD值及PI值會隨之下降明顯,表明細胞的增殖活性明顯降低,同時顯微鏡下觀察可見大量細胞崩解死亡。3、對實驗結(jié)果進行綜合分析顯示:體外hPDLSCs靜壓力加載的適宜力值為3g/cm~2,適宜加力時間為24h。此加力模式能促進hPDLSCs的增殖。4、Ad-BMP9轉(zhuǎn)染hPDLSCs的適宜MOI值為80,轉(zhuǎn)染時間為72h。Ad-BMP9實驗組細胞的生長曲線與對照組進行比較,結(jié)果表明:MOI值為80時,Ad-BMP9對細胞的毒性作用很小,對細胞的增殖不會抑制反會增強。5、3g/cm~2的靜壓力加力24h后,Ad-BMP9實驗組hPDLSCs的BMP9的基因和蛋白含量都明顯增加,表明過表達BMP9的腺病毒載體構(gòu)建成功。同時Ad-BMP9實驗組hPDLSCs成骨相關(guān)因子ALP、RUNX2、OCN的基因和蛋白表達量及成骨誘導(dǎo)后鈣鹽結(jié)節(jié)的生成量均明顯高于對照組,說明適宜靜壓力作用下,BMP9對hPDLSCs的成骨分化具有增強作用。結(jié)論:本實驗成功地培養(yǎng)、獲得hPDLSCs,并利用重物加載模型,確定“力值3g/cm~2,加力時間24h”為促進體外hPDLSCs增殖的適宜靜壓力加載方式。隨后驗證了Ad-BMP9對hPDLSCs的轉(zhuǎn)染效果,并證實:適宜靜壓力作用下,BMP9能上調(diào)hPDLSCs成骨分化因子ALP、RUNX2、OCN基因及蛋白的表達,同時能增強hPDLSCs成骨分化晚期鈣鹽結(jié)節(jié)的礦化。本實驗表明適宜靜壓力作用下,BMP9對hPDLSCs的成骨分化具有誘導(dǎo)增強的作用。
【圖文】：

7-14 天左右在顯微鏡下可觀察到部分牙周膜組織塊邊緣有細以組織塊為中心呈放射樣生長，，靠組織塊細胞密集，周邊細細胞形態(tài)可見：長梭形、三角形、扁平形、星形、不規(guī)則形態(tài)（圖 1-1A、B）。

圖 1-2 有限稀釋法純化后的 hPDLSCs（A ×40 ；B ×200 ） human periodontal ligament stem cells after limiting dilution analysis（A ×40 ；BDLSCs 生長曲線的繪制胞接種 24h 后顯微鏡下觀察：多數(shù)細胞形態(tài)恢復(fù)長梭形，少壁；細胞接種第 2 天： CCK8 法檢測結(jié)果顯示：細胞 OD 值明細胞有少量增殖；細胞傳代接種第 3-5 天：細胞增殖迅猛，，進入對數(shù)生長期；細胞接種后第 5-7 天：細胞數(shù)量逐漸趨于胞生長平臺期；下圖為 CCK8 檢測細胞增殖曲線圖，縱軸為細胞吸光光度值（OD 值），橫軸為細胞培養(yǎng)時間（圖 1-3）Cs 的生長曲線圖呈“S”型，即呈“緩慢-對數(shù)生長-平臺”模
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.5

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本文編號：2710156