【摘要】： 神經(jīng)嵴細(xì)胞(Neural Crest Cells，NCC)來源于胚胎的神經(jīng)外胚層，在發(fā)育的過程中，離開神經(jīng)管向腹側(cè)遷移，分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及多種非神經(jīng)細(xì)胞，是機(jī)體內(nèi)最具分化潛能的細(xì)胞之一。頜面部的牙乳頭、牙囊、牙周膜、骨組織以及肌肉中的大部分細(xì)胞均來源于顱神經(jīng)嵴(Cranial neural crest cells，CNCC)。因此，研究CNCC的發(fā)育和定向分化在對(duì)于理解頜面部組織和器官的形成十分必要。此外，多潛能性也使其成為組織工程中候選的種子細(xì)胞之一。 雖然人們?cè)缫淹ㄟ^體內(nèi)試驗(yàn)了解到CNCC可以向神經(jīng)譜系、成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞等方向進(jìn)行分化，但在體外的試驗(yàn)中，由于面臨CNCC的分離、取材以及在普通培養(yǎng)基中容易分化等方面的困難，目前還不十分清楚CNCC在體外如何向各個(gè)細(xì)胞譜系進(jìn)行分化，生長(zhǎng)因子對(duì)CNCC的確切作用也未見報(bào)道。為了明確CNCC的體外培養(yǎng)特性和定向誘導(dǎo)分化的條件，本實(shí)驗(yàn)從CNCC的兩大分化方向——神經(jīng)譜系和成骨細(xì)胞兩個(gè)方面，進(jìn)行了以下幾方面的研究： (1)取E8.5 Balb/C胎鼠第6體節(jié)之前的神經(jīng)管，用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)CNCC。在神經(jīng)管組織貼附后2d，剔除神經(jīng)管，原代的CNCC從組織塊周圍游出，形態(tài) 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 類似成纖維樣細(xì)胞：由生長(zhǎng)曲線計(jì)算得出＊＊＊C的倍增時(shí)間為3個(gè)4h；免疫組化 結(jié)果顯示，CNCC的特異性抗體一神經(jīng)生長(zhǎng)因子低親和力受體的抗體p75染色 陽性，Cytokeratm、Vimentin、NF、GFAP染色均為陰性。 口）觀察血清對(duì)CNCC分化的誘導(dǎo)作用，研究結(jié)果顯示，血清處理組中，， CNCC的形態(tài)由原來的成纖維樣變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)型，GFAP抗體染色為陽性；而正常無 血清組的CNCC中，GFAP染色結(jié)果為陰性。因此，血清可誘導(dǎo)CNCC向神經(jīng) 膠質(zhì)樣的細(xì)胞分化。 O）觀察不同濃度的rhBMPZ對(duì)CNCC的作用。在50ng／ml的thBMPZ培養(yǎng) 基中培養(yǎng) 10天后，CNCC的形態(tài)由成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橥黄痖L(zhǎng)度不等的、類似 于神經(jīng)元的細(xì)胞。而在常規(guī)的無血清培養(yǎng)基中，CNCC的形態(tài)基本無變化。誘 導(dǎo)后的CNCC中NF的免疫組化染色結(jié)果呈陽性反應(yīng)。透射電鏡下，rhBMPZ 處理組中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體的數(shù)量減少，并出現(xiàn)了類似神經(jīng)內(nèi)分泌的顆粒以及 神經(jīng)元突起樣的結(jié)構(gòu)。表明thBMPZ可以誘導(dǎo)CNCC向神經(jīng)元方向分化。通過 計(jì)算NF陽性細(xì)胞數(shù)可以得出，rhBMPZ作用的最適劑量為50ng／ml，其誘導(dǎo)出 的神經(jīng)元樣細(xì)胞的比例為 47．l％。 O 誘導(dǎo)CNCC前后，細(xì)胞中TH以及GAB蝴亞單位InRNA的 表達(dá)有明顯變化。RT．PCR檢測(cè)結(jié)果表明，rhBMPZ正常對(duì)照組的CNCC中，二 者未見表達(dá)。而在處理組中，二者均出現(xiàn)表達(dá)，表明CNCC在誘導(dǎo)后所分化的 神經(jīng)元是一種類似腎上腺能的神經(jīng)元c m通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法，將 BMPZ基因?qū)?CNCC，經(jīng)過 G＊ 篩選獲 得了穩(wěn)定表達(dá)BMPZ的CNCC細(xì)胞株，并通過免疫組化、原位雜交方法從蛋白 水平和轉(zhuǎn)錄水平證實(shí)了轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠表達(dá)并分泌BMPZ。BMPZ轉(zhuǎn)染后的細(xì) 胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞周圍出現(xiàn)多個(gè)突起，形態(tài)類似神經(jīng)元，NF抗體呈陽性反 應(yīng)，說明轉(zhuǎn)染后的CNCC表現(xiàn)出神經(jīng)元的表型。 的用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)CNCC，觀察其對(duì)CNCC是否可以誘導(dǎo)CNCC向成骨 細(xì)胞進(jìn)行分化。用礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)20d后，細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形向多角形轉(zhuǎn)化， 5 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 群體倍增時(shí)間延長(zhǎng)為57．sh，增殖速度減慢，但細(xì)胞中ALP活性和OC含量比 正常的＊＊＊C明顯提高（P＜o(jì)．os）。 上述研究結(jié)果表明，無血清培養(yǎng)基能夠維持CNCC的未分化狀態(tài)；血清可 以誘導(dǎo)CNCC分化為神經(jīng)膠質(zhì)樣的細(xì)胞，含血清的培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)CNCC； 50ng／Inl的 rhBMPZ可以有效地促進(jìn) CNCC分化為神經(jīng)元樣的細(xì)胞，并表達(dá) TH 和GABM亞單位InRNA；分化后的細(xì)胞類似腎上腺能神經(jīng)元；BMPZ基因 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也表現(xiàn)出神經(jīng)元的表型，進(jìn)一步確定了BMPZ對(duì)CNCC的定向誘導(dǎo) 分化作用；用礦化誘導(dǎo)液則可以誘導(dǎo)CNCC表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的表型。 研究結(jié)果提示，CNCC的培養(yǎng)需要特殊的無血清培養(yǎng)基；CNCC處于未分 化狀態(tài)，在不同的分化因素的刺激下，可向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和成骨細(xì)胞 的表型分化，可用來在體外研究頜面部組織和器官的發(fā)育，也可作為組織工程 中后選的種子細(xì)胞。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：R780.2

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本文編號(hào)：2708627