發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 14:29

【摘要】：背景感染、外傷、腫瘤、先天畸形等疾病均可以引起骨缺損。近年來(lái),基于干細(xì)胞的骨組織工程技術(shù)飛速發(fā)展,使骨再生成為可能。牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有易于取材、來(lái)源豐富、無(wú)倫理爭(zhēng)議的優(yōu)點(diǎn),是骨組織工程的重要種子細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),小分子化合物可以提供準(zhǔn)確、可修改、經(jīng)濟(jì)有效的方式來(lái)誘導(dǎo)干細(xì)胞分化。鹽酸千金藤堿是來(lái)源于千金藤屬植物,人工合成的小分子化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒及抑制破骨細(xì)胞形成的作用。目前關(guān)于鹽酸千金藤堿作用于DPSCs的相關(guān)文獻(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。目的初步探索鹽酸千金藤堿對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的影響。方法1.收集成人第三磨牙,采用組織塊貼壁法和改良酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng),有限稀釋法純化細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)。HE染色觀察DPSCs形態(tài),流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DPSCs表面標(biāo)志物,成骨分化鑒定DPSCs定向分化能力。2.檢測(cè)鹽酸千金藤堿對(duì)DPSCs增殖的影響:實(shí)驗(yàn)組DPSCs添加鹽酸千金藤堿藥物濃度分別為2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的培養(yǎng)基,對(duì)照組添加不含鹽酸千金藤堿的培養(yǎng)基,分別在加藥后的第24h、48h和72h采用MTT法檢測(cè)各組的吸光度。3.堿性磷酸酶試劑盒和Western blot檢測(cè)鹽酸千金藤堿對(duì)DPSCs成骨分化的影響。堿性磷酸酶試劑盒檢測(cè)堿性磷酸酶活性,Western blot檢測(cè)成骨蛋白OCN和Runx2的表達(dá)。結(jié)果1.體外分離培養(yǎng)的DPSCs生長(zhǎng)狀態(tài)良好。HE染色顯示,DPSCs為成纖維細(xì)胞樣形態(tài),呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核大而居中,多數(shù)為一個(gè)細(xì)胞核,偶有兩個(gè)細(xì)胞核。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:CD44陽(yáng)性表達(dá),CD45陰性表達(dá)。DPSCs成骨誘導(dǎo)21天后,茜素紅染色可見(jiàn)明顯的橙紅色礦化結(jié)節(jié);2.鹽酸千金藤堿對(duì)DPSCs增殖的影響:MTT檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,2.5μmol/L和5μmol/L濃度組可以促進(jìn)DPSCs增殖,并且呈時(shí)間依賴性(P0.05),10μmol/L濃度組對(duì)DPSCs有輕微抑制作用,但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);20μmol/L濃度組有明顯的細(xì)胞毒性作用(P0.05);3.鹽酸千金藤堿對(duì)DPSCs成骨分化的影響:與對(duì)照組相比,2.5μmol/L和5μmol/L濃度組可以提高DPSCs堿性磷酸酶活性(P0.05),并且上調(diào)成骨相關(guān)蛋白OCN和Runx2的表達(dá)(P0.05),10μmol/L濃度組與對(duì)照組相比,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.2.5μmol/L和5μmol/L濃度的鹽酸千金藤堿可以提高DPSCs的增殖和成骨分化能力。2.20μmol/L濃度的鹽酸千金藤堿對(duì)牙髓干細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用。
【圖文】：

生長(zhǎng)狀態(tài)良好的 P3 代細(xì)胞，，以 3×104個(gè)/mL 的密度接種在 6 孔板中，待長(zhǎng)滿 80%左右，分為對(duì)照組與成骨誘導(dǎo)組，各 3 孔，對(duì)照組用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)，成骨誘導(dǎo)組用成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)，每 3d 換液一次，連續(xù)培養(yǎng) 21d，然 10%多聚甲醛固定細(xì)胞約 10min，茜素紅染色 20min，吸棄染液，PBS 緩沖滌 2-3 次，倒置相差顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 牙髓干細(xì)胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)第 10-12 天時(shí)鏡下見(jiàn)有少數(shù)細(xì)胞從組織塊邊緣游離(圖 1.1A)；培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞包圍組織塊呈放射狀向周邊游離，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞多數(shù)呈長(zhǎng)，即成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，也有多角形或紡錘狀等形態(tài)，其中有上皮混雜.1B)；通過(guò)有限稀釋法得到單克隆細(xì)胞(圖 1.1C)；通過(guò)傳代培養(yǎng)使 DPSCs 在大量擴(kuò)增(圖 1.1D)。

牙髓干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線PSCs 生長(zhǎng)曲線為典型的“S”型曲線。DPSCs 在接種的第 1-2 天，，處于停滯期，在第 2 天開(kāi)始增長(zhǎng)加速，很快進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，，第 6 天開(kāi)始進(jìn)入平臺(tái)期，細(xì)胞增殖速度變慢，說(shuō)明培養(yǎng)的 DPS好，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖 1.2）。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉國(guó)卿,陳曙光,馬志清;千金藤堿等異喹啉類生物堿對(duì)5—羥色胺受體的阻斷作用[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);1988年02期

2 李煒;周詳;錢萍;沈建榮;;不同濃度的鹽酸千金藤堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)研究[J];中華全科醫(yī)學(xué);2015年04期

3 張壯麗;王陸巡;趙寧;趙志鴻;王桂芳;張小俊;;噴霧干燥法制備鹽酸千金藤堿微囊[J];中成藥;2014年08期

4 王曉麗;鄭立運(yùn);張艷;王寧;江金花;馬方;王慶端;;鹽酸千金藤堿對(duì)急性肝損傷小鼠保護(hù)作用的研究[J];中華中醫(yī)藥雜志;2009年10期

5 馬方;張艷;王寧;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿對(duì)急性脂肪肝小鼠脂代謝及過(guò)氧化的影響[J];中華中醫(yī)藥雜志;2011年06期

6 王曉;鄭立運(yùn);趙志鴻;張艷;周玉冰;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿抗乙型肝炎病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究[J];時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥;2010年12期

7 夏薇;馬方;江金花;王桂芳;張小俊;王慶端;;鹽酸千金藤堿對(duì)環(huán)磷酰胺所致小鼠白細(xì)胞減少的治療作用[J];鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年03期

8 馬志清,劉國(guó)卿,霍小萍;左旋千金藤堿的中樞抑制作用[J];中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào);1990年02期

9 吳冬梅;崔英;;鹽酸千金藤堿對(duì)鼻咽癌SUNE-1細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的觀察[J];中華腫瘤防治雜志;2009年09期

10 張廷偉;頭花千金藤提取制劑千金藤堿對(duì)干擾素的誘導(dǎo)作用及與其他藥物的比較研究[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(中醫(yī)中藥分冊(cè));1998年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 韓立;張艷;臧彩虹;王寧;江金花;馬方;王慶端;;鹽酸千金藤堿對(duì)小鼠外周血P糖蛋白的調(diào)節(jié)作用與逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的相關(guān)性研究[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2011年

2 王曉;鄭立運(yùn);張艷;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿體外抑制乙肝病毒的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議�？痆C];2009年

3 王慶端;王欣;江金花;張艷;王寧;;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)小鼠肝癌多藥耐藥作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議�？痆C];2009年

4 韓立;馬琳;張晶敏;陳曉靜;江金花;馬方;王慶端;;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[A];2013醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

5 張晶敏;陳曉靜;馬琳;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響[A];2013醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

6 周玉冰;王亞峰;張艷;鄭立運(yùn);楊小昂;王寧;江金花;馬方;王慶端;;鹽酸千金藤堿對(duì)拉米夫定耐藥乙型肝炎病毒的體外抑制作用[A];中國(guó)藥理學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)學(xué)術(shù)會(huì)議專刊[C];2011年

7 李潔;夏薇;王寧;馬方;王慶端;;鹽酸千金藤堿防治腫瘤放化療所致白細(xì)胞降低的作用與骨髓CD34~+造血干細(xì)胞的關(guān)系及其輔助化療的作用[A];2007醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

8 韓立;夏薇;王寧;張艷;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性及其與P糖蛋白表達(dá)和功能的關(guān)系[A];2007醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2007年

9 趙哲;趙紅宇;王瑤;岳二麗;張煒;黃彬;鐘巍;王一飛;;鹽酸千金藤堿對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[A];第十三次全國(guó)老年口腔醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2018年

10 王寧;韓立;張艷;江金花;王慶端;;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性及其與P糖蛋白的關(guān)系[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 俊英;鹽酸千金藤堿可護(hù)肝[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2009年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前4條

1 黃晨征;鹽酸千金藤堿對(duì)人卵巢癌的作用及其機(jī)制的研究[D];鄭州大學(xué);2017年

2 吳冬梅;抗鼻咽癌中草藥的篩選和鹽酸千金藤堿對(duì)鼻咽癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制的初步探討[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2009年

3 韓立;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的作用及其機(jī)制[D];鄭州大學(xué);2013年

4 呂劍濤;千金藤素對(duì)化療藥物減毒增效及抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙哲;鹽酸千金藤堿對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖和成骨分化能力的影響[D];鄭州大學(xué);2019年

2 趙美淇;千金藤堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞CNE-2和5-8F的作用及機(jī)制研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2019年

3 張夢(mèng)雅;千金藤堿對(duì)人鼻咽癌細(xì)胞的放療增敏作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2018年

4 金桔;千金藤堿對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖及成骨分化的作用的研究[D];廣東藥科大學(xué);2017年

5 李潔;鹽酸千金藤堿防治腫瘤化療所致白細(xì)胞減少與骨髓CD34～+造血干細(xì)胞的關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2007年

6 張貞;二氫楊梅素和鹽酸千金藤堿對(duì)人牙周膜細(xì)胞群增殖以分化能力影響的初步探究[D];鄭州大學(xué);2016年

7 武亞玲;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)K562/ADR的多藥耐藥性及其與Bcl-2和P210～（bcr/abl）的關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2005年

8 周朋君;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)食管鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥的作用機(jī)制研究[D];廣東藥科大學(xué);2016年

9 董紅敬;廣西地不容生物堿高速逆流色譜制備技術(shù)及提取工藝研究[D];山東中醫(yī)藥大學(xué);2012年

10 韓立;鹽酸千金藤堿逆轉(zhuǎn)K562/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性及其與P糖蛋白表達(dá)和功能的關(guān)系[D];鄭州大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2703220