【摘要】：背景感染、外傷、腫瘤、先天畸形等疾病均可以引起骨缺損。近年來,基于干細胞的骨組織工程技術(shù)飛速發(fā)展,使骨再生成為可能。牙髓干細胞(dental pulp stem cells,DPSCs)具有易于取材、來源豐富、無倫理爭議的優(yōu)點,是骨組織工程的重要種子細胞。研究發(fā)現(xiàn),小分子化合物可以提供準確、可修改、經(jīng)濟有效的方式來誘導干細胞分化。鹽酸千金藤堿是來源于千金藤屬植物,人工合成的小分子化合物,具有抗炎、抗腫瘤、抗病毒及抑制破骨細胞形成的作用。目前關(guān)于鹽酸千金藤堿作用于DPSCs的相關(guān)文獻尚未見報道。目的初步探索鹽酸千金藤堿對牙髓干細胞增殖和成骨分化能力的影響。方法1.收集成人第三磨牙,采用組織塊貼壁法和改良酶消化法進行原代培養(yǎng),有限稀釋法純化細胞并擴大培養(yǎng)。HE染色觀察DPSCs形態(tài),流式細胞技術(shù)檢測DPSCs表面標志物,成骨分化鑒定DPSCs定向分化能力。2.檢測鹽酸千金藤堿對DPSCs增殖的影響:實驗組DPSCs添加鹽酸千金藤堿藥物濃度分別為2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L的培養(yǎng)基,對照組添加不含鹽酸千金藤堿的培養(yǎng)基,分別在加藥后的第24h、48h和72h采用MTT法檢測各組的吸光度。3.堿性磷酸酶試劑盒和Western blot檢測鹽酸千金藤堿對DPSCs成骨分化的影響。堿性磷酸酶試劑盒檢測堿性磷酸酶活性,Western blot檢測成骨蛋白OCN和Runx2的表達。結(jié)果1.體外分離培養(yǎng)的DPSCs生長狀態(tài)良好。HE染色顯示,DPSCs為成纖維細胞樣形態(tài),呈長梭形,細胞核大而居中,多數(shù)為一個細胞核,偶有兩個細胞核。流式細胞儀檢測顯示:CD44陽性表達,CD45陰性表達。DPSCs成骨誘導21天后,茜素紅染色可見明顯的橙紅色礦化結(jié)節(jié);2.鹽酸千金藤堿對DPSCs增殖的影響:MTT檢測顯示,與對照組相比,2.5μmol/L和5μmol/L濃度組可以促進DPSCs增殖,并且呈時間依賴性(P0.05),10μmol/L濃度組對DPSCs有輕微抑制作用,但是差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);20μmol/L濃度組有明顯的細胞毒性作用(P0.05);3.鹽酸千金藤堿對DPSCs成骨分化的影響:與對照組相比,2.5μmol/L和5μmol/L濃度組可以提高DPSCs堿性磷酸酶活性(P0.05),并且上調(diào)成骨相關(guān)蛋白OCN和Runx2的表達(P0.05),10μmol/L濃度組與對照組相比,差異均無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論1.2.5μmol/L和5μmol/L濃度的鹽酸千金藤堿可以提高DPSCs的增殖和成骨分化能力。2.20μmol/L濃度的鹽酸千金藤堿對牙髓干細胞有細胞毒性作用。
【圖文】：

生長狀態(tài)良好的 P3 代細胞，，以 3×104個/mL 的密度接種在 6 孔板中，待長滿 80%左右，分為對照組與成骨誘導組，各 3 孔，對照組用傳代培養(yǎng)基培養(yǎng)，成骨誘導組用成骨誘導液培養(yǎng)，每 3d 換液一次，連續(xù)培養(yǎng) 21d，然 10%多聚甲醛固定細胞約 10min，茜素紅染色 20min，吸棄染液，PBS 緩沖滌 2-3 次，倒置相差顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。3 實驗結(jié)果3.1 牙髓干細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)第 10-12 天時鏡下見有少數(shù)細胞從組織塊邊緣游離(圖 1.1A)；培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)細胞包圍組織塊呈放射狀向周邊游離，貼壁生長，細胞多數(shù)呈長，即成纖維細胞樣形態(tài)，也有多角形或紡錘狀等形態(tài)，其中有上皮混雜.1B)；通過有限稀釋法得到單克隆細胞(圖 1.1C)；通過傳代培養(yǎng)使 DPSCs 在大量擴增(圖 1.1D)。

牙髓干細胞生長曲線PSCs 生長曲線為典型的“S”型曲線。DPSCs 在接種的第 1-2 天，，處于停滯期，在第 2 天開始增長加速，很快進入快速生長期，，第 6 天開始進入平臺期，細胞增殖速度變慢，說明培養(yǎng)的 DPS好，取對數(shù)期細胞進行實驗（圖 1.2）。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R78

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本文編號：2703220