【摘要】： 牙周炎以細(xì)菌誘發(fā)為始動因子,需在宿主、環(huán)境、遺傳等因素共同作用下導(dǎo)致發(fā)病。大量研究已經(jīng)證明,吸煙能極大地增加牙周破壞的風(fēng)險,是牙周炎的危險因素。然而,到目前為止,吸煙對牙周組織的破壞機制、對牙周炎發(fā)生發(fā)展過程的影響仍不明了。尼古丁是煙草的主要成分,有學(xué)者推測,尼古丁可能在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)包含:乙酰膽堿,乙酰膽堿酯酶,膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶,煙堿型乙酰膽堿受體和毒蕈堿型乙酰膽堿受體及乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體。研究認(rèn)為,尼古丁作為煙草的主要化學(xué)物質(zhì)之一,是非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)中煙堿型乙酰膽堿受體的特異性配體。尼古丁與細(xì)胞膜上的煙堿型乙酰膽堿受體特異性結(jié)合后,經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo),產(chǎn)生效應(yīng)。也就是說,作為煙堿型乙酰膽堿受體特異性配體的尼古丁,可以代替乙酰膽堿,侵入局部非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò),發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。已有研究報道在人牙齦上皮細(xì)胞中存在非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)。我們前期研究證實,人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblasts,人PDLF)中存在煙堿型乙酰膽堿受體,且尼古丁可上調(diào)該受體表達(dá)。然而,人PDLF中是否存在完整的非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng),尼古丁是否通過該系統(tǒng)發(fā)揮作用,目前尚不清楚。本實驗所用藥物為尼古丁以及-銀環(huán)蛇毒素( -BTX)。其中, -BTX是煙堿型乙酰膽堿受體7亞型( 7nAChR)的特異性拮抗劑,能夠特異性結(jié)合人體內(nèi)7nAChR。 本研究采用細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光、蛋白印跡等方法觀察人PDLF中是否存在非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的另一重要成員乙酰膽堿酯酶,以及尼古丁對該酶的影響,旨在從另一方面探討尼古丁對非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的作用,有助于闡明吸煙相關(guān)性牙周炎發(fā)生發(fā)展的作用機制。 第一部分實驗人牙周膜成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)及鑒定 1主要方法 取因正畸治療需要拔除的12-14歲健康人前磨牙,無菌條件下刮取根中1/3牙周膜組織,采用組織塊法進行原代培養(yǎng),待原代培養(yǎng)成功后,常規(guī)傳代,免疫組化方法進行抗波形絲蛋白、抗角蛋白染色,顯微鏡下觀察。 2主要結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底,密度均勻,呈星形或長梭形,細(xì)胞胞漿均勻,細(xì)胞質(zhì)豐滿,細(xì)胞核為圓形,細(xì)胞排列呈旋渦狀或放射狀。免疫組化結(jié)果顯示培養(yǎng)細(xì)胞抗波形絲蛋白染色陽性,抗角蛋白染色為陰性。 3主要結(jié)論 本實驗所培養(yǎng)細(xì)胞為來源于中胚層的人PDLF。 第二部分實驗免疫熒光檢測人牙周膜成纖維細(xì)胞中是否表達(dá)乙酰膽堿酯酶 1主要方法 選取第5代人PDLF接種于24孔板,加液(低糖DMEM,5%小牛血清),于37℃,5㳠CO2條件下在孵箱內(nèi)培養(yǎng)24小時,選取人表皮上皮細(xì)胞作為陽性對照。免疫熒光法檢測細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶的表達(dá)情況。 2主要結(jié)果 作為對照組的人表皮上皮細(xì)胞中,圖片綠色區(qū)域為陽性表達(dá),主要分布在胞漿內(nèi)。而人PDLF中細(xì)胞胞漿內(nèi)也有陽性表達(dá)。 3主要結(jié)論 免疫熒光檢測結(jié)果表明人PDLF存在乙酰膽堿酯酶的表達(dá),表達(dá)部位在細(xì)胞胞漿。提示在人PDLF中存在乙酰膽堿酯酶。結(jié)合前期和同期的研究,人PDLF中存在7nAChR和膽堿乙�；D(zhuǎn)移酶的表達(dá),證實在人牙周膜組織中可能存在非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng),尼古丁作為7nAChR的激動劑,可能通過作用于該系統(tǒng),對牙周組織產(chǎn)生影響。 第三部分實驗蛋白印跡檢測尼古丁及α-銀環(huán)蛇毒素對人牙周膜成纖維細(xì)胞中乙酰膽堿酯酶表達(dá)的影響 1主要方法 選第5代人PDLF和人表皮上皮細(xì)胞接種于75cm2培養(yǎng)瓶中,分5組:尼古丁組(N組,尼古丁10-12mol"L),尼古丁+ -BTX組(N+組,10-12mol"L尼古丁+10-9mol"L -BTX), -BTX組(組,10-9mol"L -BTX),空白對照組(B組)和陽性對照組(P組)。各組給予相應(yīng)濃度的藥物,培養(yǎng)24小時后,提取細(xì)胞總蛋白,進行蛋白定量、轉(zhuǎn)膜、SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳,封閉,孵育,最后進行顯色。 2主要結(jié)果 各組均在82kDa位置呈現(xiàn)條帶。根據(jù)軟件分析,各組乙酰膽堿酯酶表達(dá)由強至弱依次是N組、P組、N+組、B組、組。 3主要結(jié)論 正常人PDLF中存在乙酰膽堿酯酶,一定濃度的尼古丁可上調(diào)該酶蛋白的表達(dá), -BTX可拮抗其表達(dá)。結(jié)合前期和同期的實驗結(jié)果,尼古丁的介入,改變了人PDLF中非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)各成員的表達(dá),打破了非神經(jīng)乙酰膽堿能系統(tǒng)的平衡。由于該系統(tǒng)在疾病發(fā)生發(fā)展中起到一定作用,提示尼古丁很可能通過作用于該系統(tǒng)來影響牙周炎的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

分別加多克隆二抗 37 ℃孵育 1h，反復(fù) PBS 沖洗 3 次；DAB 顯色，自來水洗滌；常規(guī)脫水，于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。 1 是原代培養(yǎng) 10 天后的細(xì)胞圖片。如圖所見，在倒置顯微鏡組織塊旁爬出的長梭形成纖維樣細(xì)胞。圖 2 是在倒置顯微鏡下胞形態(tài)和生長情況。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，密度均勻，呈星形或漿均勻，細(xì)胞質(zhì)豐滿，細(xì)胞核為圓形，細(xì)胞排列呈旋渦狀或放免疫組化結(jié)果。如圖 3 顯示體外培養(yǎng)細(xì)胞波形絲蛋白陽性，其呈棕黃色。角蛋白染色為陰性。

-30-圖 3 波形絲蛋白免疫組化染色陽性胞培養(yǎng)常采用組織塊法和消化法。本實驗采用的是組簡便，成功率較高。除此以外，，本實驗在原有組織塊法上加蓋了蓋玻片。人 PDLF 是貼壁生長細(xì)胞。貼壁問較關(guān)鍵。牙周膜組織量較少，原代培養(yǎng)時刮下來的組優(yōu)點主要就是幫助本來不多的組織更好地貼壁，加用
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R781.4

【參考文獻】

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本文編號：2697453