【摘要】： 牙齒的發(fā)育是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,包括上皮間充質(zhì)相互作用、細(xì)胞分化、形態(tài)發(fā)生、組織礦化和萌出,在這一過(guò)程中有眾多生物因子參與并互相協(xié)調(diào)構(gòu)成調(diào)控牙齒發(fā)育的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。 氯離子通道是生物體內(nèi)一種重要的陰離子通道,它們?cè)诩?xì)胞膜和胞內(nèi)細(xì)胞器質(zhì)膜的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著特定的生物學(xué)功能。最新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示,牙齒組織中有氯離子通道存在,某些氯離子通道基因敲除小鼠模型(CFTR和ClC-5)出現(xiàn)了明顯的牙齒結(jié)構(gòu)和形態(tài)異常。ClC-7是電壓門(mén)控氯離子通道家族的一個(gè)成員,在體內(nèi)廣泛存在。研究表明ClC-7與某些骨遺傳性疾病密切相關(guān),人們?cè)谘芯緾lcn7-/-小鼠的過(guò)程中發(fā)現(xiàn),Clcn7-/-小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的視網(wǎng)膜變性和骨硬化癥等癥狀,并伴有牙齒不萌出的現(xiàn)象,同時(shí)在嬰兒骨硬化患者中也發(fā)現(xiàn)了CLCN7基因的突變型。結(jié)合氯離子通道特別是ClC-7的生理功能和牙胚發(fā)育的自身特點(diǎn),以及牙齒和骨在組織結(jié)構(gòu)上具有的相似性,我們提出這樣的假設(shè):ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過(guò)程。 本課題采用免疫組織學(xué)、原位雜交、RT-PCR和細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)進(jìn)行了以下三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)研究: 第一部分ClC-7在小鼠牙胚中的表達(dá)研究 本部分首先應(yīng)用RT-PCR方法證實(shí)出生1d的小鼠牙胚中有Clcn7的表達(dá),然后應(yīng)用免疫熒光技術(shù)來(lái)確定小鼠牙胚中ClC-7蛋白表達(dá)分布模式和原位雜交的方法觀察Clcn7 mRNA在小鼠牙胚中的表達(dá)。ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在小鼠鐘狀期牙胚中廣泛表達(dá)。小鼠磨牙牙胚鐘狀早期,內(nèi)釉上皮層細(xì)胞、中間層細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞都有ClC-7陽(yáng)性表達(dá),內(nèi)釉上皮層呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá);小鼠磨牙牙胚鐘狀晚期,ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中存在陽(yáng)性表達(dá),同時(shí)在牙乳頭細(xì)胞、星網(wǎng)狀層細(xì)胞也呈陽(yáng)性表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明電壓門(mén)控氯離子通道ClC-7可能在牙齒發(fā)育過(guò)程中具有一定的調(diào)控作用,可能參與了成牙本質(zhì)細(xì)胞、成釉細(xì)胞的生理過(guò)程。 第二部分ClC-7在牙齒相關(guān)細(xì)胞中的表達(dá)研究 本部分實(shí)驗(yàn)采用RT-PCR和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)了Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白在體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中的表達(dá)情況。結(jié)果表明,成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中都有Clcn7 mRNA和ClC-7蛋白的表達(dá),兩種細(xì)胞中Clcn7 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,但成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23中ClC-7蛋白表達(dá)水平要高于成釉細(xì)胞樣細(xì)胞ClC-7蛋白表達(dá)水平。本部分結(jié)果揭示,成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23可以做為進(jìn)一步研究ClC-7參與牙齒發(fā)育調(diào)控機(jī)制的細(xì)胞模型,為今后研究ClC-7在成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞中的生理作用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第三部分ClC-7在牙乳頭細(xì)胞分化中的作用研究 本部分采用原代細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),體外培養(yǎng)小鼠牙乳頭細(xì)胞,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入終濃度為25ng/ml的M-CSF和終濃度為50ng/ml的RANKL誘導(dǎo)48h,對(duì)照組不加任何誘導(dǎo)因子,然后采用免疫熒光染色、原位雜交和RT-PCR的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表達(dá)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,加入誘導(dǎo)因子M-CSF和RANKL的牙乳頭細(xì)胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA表達(dá)均高于對(duì)照組。本部分研究表明,M-CSF和RANKL可以提高ClC-7在牙乳頭細(xì)胞中的表達(dá)水平,可能促進(jìn)了牙乳頭細(xì)胞的分化,但M-CSF和RANKL促進(jìn)牙乳頭細(xì)胞中ClC-7蛋白和Clcn7 mRNA水平升高的機(jī)制和途徑有待于進(jìn)一步研究,提示ClC-7可能參與了牙乳頭的分化。 綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,ClC-7在小鼠牙胚中有特異性空間表達(dá),并且在體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8、成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞MDPC-23也有表達(dá),ClC-7可能參與了牙齒的發(fā)育過(guò)程;經(jīng)M-CSF和RANKL誘導(dǎo)的牙乳頭細(xì)胞ClC-7表達(dá)水平升高,揭示ClC-7可能與牙乳頭細(xì)胞的分化相關(guān)。
【圖文】：

-/-小鼠骨骼系統(tǒng)異常，，是由于其體內(nèi)破骨細(xì)胞功能喪失，導(dǎo)致骨圖1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠體形 圖2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X線片圖3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨X線片 圖4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨切片-16-

圖1 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠體形 圖2 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠骨骼X線片圖3 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨X線片 圖4 正常小鼠和Clcn7-/-小鼠的脛骨切片-16-
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R78

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 趙征;金巖;文玲英;;ADAM28在小鼠牙胚發(fā)育中的時(shí)空表達(dá)[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

本文編號(hào)：2664502