【摘要】：口腔鱗癌是口腔部位及周邊最為常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率占到口腔部位腫瘤總發(fā)病率的80%以上,是值得引起人們高度關注和重視的惡性疾病之一。雖然在歐美等發(fā)達國家口腔鱗癌的發(fā)病率有所下降,但在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率仍然呈現(xiàn)上升趨勢。近年來隨著醫(yī)療水平的不斷提高,許多惡性腫瘤的治療方面取得了不小的進步,通過治療提高了患者的5年生存率。但在口腔鱗癌的治療方面,由于此疾病的發(fā)生早期不易被患者察覺等特殊性,致使該疾病的治療滯后,癌癥晚期的治療難度加大。因而有必要加大對口腔鱗癌治療的關注度,尋找出口腔鱗癌的更好的治療方法。 口腔鱗癌的治療方面,常規(guī)的治療方法包括手術治療、放射治療、化學治療、免疫治療等。這些治療方法雖然在一定程度上會抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,但又存在較大的治療弊端。例如放療、化療會不可避免的引起嚴重副反應而手術治療存在操作不易進行等特點,單純手術治療無法根治腫瘤等方面的缺陷。免疫治療的療效并不明顯。而基因治療和分子靶向治療為近年來新興的腫瘤治療手段,由于其副反應小、療效確切等方面的優(yōu)勢得到了科研工作者的青睞�；蛑委熤械腞NA干涉技術為近年來新興的疾病診療技術,找到疾病致病的相關靶基因,對其進行干預可有效的阻止疾病的進程,尤其在腫瘤治療中越來越多的引起人們的關注。 STAT3基因為信號轉導活化因子3的編碼基因,其常被視為原癌基因。STAT3信號傳導通路的下游通路可影響許多推進腫瘤進程的相關因子的表達,諸如cyclinD1、Bcl-xl、survivin、c-myc等因子。此外STAT3還參與了腫瘤的免疫逃逸過程,因而將STAT3基因作為腫瘤基因治療的靶點,對其進行相應的干預,可成為腫瘤治療的有效手段。 本研究正是利用了基因治療中的RNA干涉療法,將腫瘤相關的癌基因STAT3作為治療靶點,設計了針對STAT3基因位點的RNAi質(zhì)粒,將質(zhì)粒導入口腔鱗癌細胞,首先在體外觀察該質(zhì)粒的RNA干涉效應對口腔鱗癌進程的影響,之后利用口腔鱗癌動物模型進行相關的動物體內(nèi)實驗,驗證RNAi對STAT3基因進行干預后所產(chǎn)生的腫瘤抑制效果。 本研究對口腔鱗癌的治療方法進行了全新的探索,有望通過本研究開辟出口腔鱗癌治療的新途徑。 目的: 探討通過RNA干涉技術對STAT3基因進行敲除對口腔鱗癌細胞造成的體外抑制以及對口腔鱗癌動物模型的抑瘤效果。 方法: (1)應用免疫組化方法檢測正�？谇火つそM織、不典型增生組織及口腔鱗癌組織中STAT3、EGF及EGFR蛋白的表達。 (2)應用基因重組技術構建出STAT3基因的干擾質(zhì)粒,即psilencer1.0- U6-stat3-siRNA質(zhì)粒。 (3)應用基因工程下游技術,諸如Western blot、RT-PCR、免疫組化等方法在體外和體內(nèi)對不同實驗分組的口腔鱗癌腫瘤細胞的STAT3 mRNA表達水平及相關蛋白的表達情況進行檢測,判斷RNAi的抑瘤效果。 (4)體外實驗:針對RNAi的干擾位點設計STAT3的siRNA模板,在體外成功設計并合成出該模板,對質(zhì)粒載體進行酶切,使其線性化并進行回收。之后對樣本進行核算定量。利用T4連接酶將線性質(zhì)粒載體同干擾片段進行連接。之后進行感受態(tài)細胞的制備,再將重組質(zhì)粒同感受態(tài)細胞共同孵育,進行質(zhì)粒對感受態(tài)細胞的轉化。要進行重組質(zhì)粒的提取與鑒定。之后進行重組質(zhì)粒對細胞的轉染。轉染要按照如下的方式進行實驗分組,實驗分為四組,包括陽性重組質(zhì)粒實驗組;陰性重組質(zhì)粒對照組;空白質(zhì)粒對照組;空白溶劑對照組。實驗分組的相應實驗完成后,進行相關體外實驗對各組STAT3相關蛋白表達的抑制情況進行檢測。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,經(jīng)過蛋白質(zhì)的電轉移,封閉,抗體的結合,顯色照相等步驟完成免疫印跡實驗;對轉染細胞的總RNA進行提取,經(jīng)RNA定量,cDNA的獲取及逆轉錄反應,引物合成,聚合酶鏈式反應,PCR產(chǎn)物的檢測等步驟對STAT3 mRNA的表達情況進行檢測;利用流式細胞儀對實驗細胞的凋亡情況進行檢測;配置比色試劑,對細胞進行胰蛋白酶的酶解,進行顯色、比色等步驟對細胞凋亡情況進行MTT法的相關檢測。 (5)體內(nèi)實驗:將人Tca8113舌鱗癌細胞重懸培養(yǎng)后對裸鼠進行背部的接種,建立人舌鱗癌的裸鼠動物模型,待腫瘤體積增長到50mm3后模型建立成功。之后利用電轉染的方法將psilencer1.0-U6-stat3-siRNA重組質(zhì)粒及空白質(zhì)粒、對照質(zhì)粒轉入腫瘤組織的癌細胞內(nèi)。定期對腫瘤的生長情況進行檢測,定期檢測各組裸鼠腫瘤體積的增長速度并在實驗結束后取下腫瘤,對腫瘤的重量進行測定。利用RT-PCR方法檢測STAT3基因的mRNA表達情況,利用western blot方法檢測STAT3及其相關基因MMP2、VEGF的蛋白表達情況,利用免疫組化方法檢測STAT3及其相關基因BAX、BCL-2的表達情況。 結果: (1)免疫組化研究結果顯示:口腔鱗癌癌變過程中STAT3蛋白表達在正常黏膜組織、不典型增生組織及癌組織中的表達率依次增高,分別為13.3%(8/60)、30.0%(9/30)、71.2%(43/60)組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);而EGF蛋白在正�？谇火つそM織、不典型增生組織及口腔鱗癌組織中的表達率分別為25.0%(15/60)、46.7%(14/30)、76.7%(46/60),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);EGFR在正常黏膜組織、不典型增生組織及癌組織中的表達率分別為15.0%(9/60)、36.7%(11/30)、70.0%(42/60),組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),三者呈正相關關系�？谇击[癌組織中STAT3蛋白表達與癌的組織學分級、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關(P0.05); EGF及EGFR蛋白表達均與癌的組織浸潤深度及淋巴結轉移密切相關(P0.05)。 (2)經(jīng)相關的酶切檢定,檢測出了psilencer1.0-U6-stat3-siRNA質(zhì)粒構建成功。 (3)體外實驗的實驗結果:研究結果表明,實驗組重組質(zhì)粒對舌鱗癌細胞具備較強的促細胞凋亡和增殖抑制作用;Western blot的實驗結果和逆轉錄PCR的實驗結果均顯示重組質(zhì)粒對細胞的增殖產(chǎn)生抑制效果,對細胞的凋亡產(chǎn)生促進效果,為了驗證重組質(zhì)粒的促凋亡、抑制增殖的分子機制,特進行了MTT實驗和流式細胞儀檢測細胞周期實驗。MTT實驗的結果顯示重組質(zhì)�？擅黠@的抑制細胞的增殖,而流式細胞儀實驗則顯示重組質(zhì)粒將細胞周期阻斷在G0/G1分期,在正常2倍體峰之前出現(xiàn)了亞二倍體峰,具備較高的凋亡率。 (4)體內(nèi)實驗的實驗結果:成功的構建出口腔鱗癌裸鼠皮下移植瘤動物模型,實驗組動物的腫瘤體積增長速度明顯小于其他對照組腫瘤體積的生長速度(p0.05)。實驗組動物腫瘤的最終體積要明顯小于各對照組動物腫瘤的最終體積(P0.05)。RT-PCR檢測STAT3基因mRNA的表達情況顯示實驗組的STAT3 mRNA的表達水平要明顯高于對照組(P0.05),western blot方法檢測STAT3及其相關基因MMP2、VEGF的蛋白表達情況顯示實驗組的蛋白表達量要明顯的低于對照組(P0.05),免疫組化方法檢測STAT3及其相關基因BAX、BCL-2的表達情況顯示實驗組的相關蛋白表達量要明顯低于對照組(P0.05)。 結論: (1)STAT3、EGF及EGFR在口腔鱗癌的浸潤、轉移及粘膜上皮癌變過程中起著重要作用,提示聯(lián)合檢測STAT3、EGF及EGFR可望成為口腔鱗癌早期診斷和判斷預后的客觀指標之一。 (2)涉及STAT3的siRNA基因阻斷質(zhì)粒,成功進行細胞轉染后,可有效的抑制口腔鱗癌細胞中STAT3信號傳導通路的激活和信息傳遞。信號傳導通路的抑制又使腫瘤細胞的細胞周期被阻斷,誘導口腔鱗癌細胞的體外凋亡。該結論提示可將STAT3 siRNA作為口腔鱗癌的治療分子。 (3)體內(nèi)實驗的實驗結果表明,成功的轉染STAT3 siRNA質(zhì)粒進入實驗模型的腫瘤部位后可有效的抑制腫瘤體積的增長。對STAT3基因表達的抑制可致使該信號通路下游的MMP-2及VEGF分子的表達被抑制,這提示對STAT3信號通路抑制,可間接抑制MMP-2、VEGF等腫瘤相關基因的表達,進而抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。
【圖文】：

分[強陽性（+++）]細胞漿內(nèi)可見大量的深紫藍色1）的評分×項目（2）的評分。其中，陰性為＜用 SPSS11.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，以 α=0.05 為驗來檢測樣本率，Spearman 分析軟件來分析相表達及其與口腔鱗癌臨床生物學行為的關系性表達主要位于腫瘤細胞的胞質(zhì)內(nèi)，部分陽性細(見圖1)。在口腔鱗癌中表達率為71.2%；在不典型分別為30.0%，，13.3%）。三者比較有統(tǒng)計學意義（白表達與口腔鱗癌患者組織學分級、浸潤深度、989，5.602，P <0.05）（表2）。

圖 2 EGF 蛋白在鱗癌組織中的表達（SP×400）表達及其與口腔鱗癌臨床生物學的行為的關系性部位定位于細胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色或深黃色（見在不典型增生和正�？谇火つぶ械谋磉_降低（分計學意義（P<0.05）（表 1）。EGFR 蛋白表達在口統(tǒng)計學意義（P>0.05），EGFR 蛋白表達與口腔鱗移有關（χ2分別為33.112，14.557，2.824，P<0
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R739.8

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本文編號：2656787