【摘要】：目的:近年來(lái),將腫瘤細(xì)胞植入裸鼠口腔構(gòu)建的原位異種移植瘤模型已廣泛應(yīng)用于口腔癌的研究。但在某些研究中為了快速評(píng)估某些新型靶向藥物對(duì)頭頸部腫瘤體內(nèi)增殖抑制的初步效果,需要快速構(gòu)建以成瘤時(shí)間短、腫瘤生長(zhǎng)速度快為主要特點(diǎn)的移植瘤模型;另一方面,在某些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究中,需要構(gòu)建以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高為主要特點(diǎn)的移植瘤模型。然而以往有關(guān)比較不同細(xì)胞系構(gòu)建的口腔癌原位異種移植瘤模型在腫瘤形成時(shí)間、增殖速度、轉(zhuǎn)移水平等方面差異的總結(jié)報(bào)道相對(duì)較少,探索使用何種口腔癌細(xì)胞系可短時(shí)間內(nèi)構(gòu)建以增殖速度快為主要特點(diǎn)的移植瘤模型,或者是以轉(zhuǎn)移率高為主要特點(diǎn)的移植瘤模型,是提高構(gòu)建口腔癌原位異種移植瘤模型效率,需要解決的首要問(wèn)題。此外,不同口腔癌細(xì)胞系構(gòu)建的原位異種移植瘤模型在腫瘤形成、增殖及轉(zhuǎn)移等方面具有差異的原因尚不明確,因此本研究擬使用在口腔癌研究中使用較多的CAL27、SCC9及SAS三種人舌癌細(xì)胞系構(gòu)建口腔癌原位異種移植瘤裸鼠模型,比較三組移植瘤模型在腫瘤形成時(shí)間、增殖速度、轉(zhuǎn)移水平等方面的差異,并對(duì)與腫瘤原位增殖及轉(zhuǎn)移可能相關(guān)的影響因素進(jìn)行初步分析,旨為提高移植瘤模型構(gòu)建的效率,并為需要構(gòu)建符合研究目的口腔癌原位異種移植瘤模型的研究者提供選擇性參考。方法:(1)預(yù)實(shí)驗(yàn)中將45只裸鼠隨機(jī)分為9組,每組5只,調(diào)節(jié)CAL27、SCC9及SAS細(xì)胞至5×10~6個(gè)/ml、1×10~7個(gè)/ml和2×10~7個(gè)/ml 3個(gè)不同細(xì)胞濃度,分別于每組裸鼠舌部注入50ul細(xì)胞懸液,觀測(cè)裸鼠舌部成瘤情況,選出合適的細(xì)胞濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。(2)將15只裸鼠隨機(jī)分為3組,每組5只,分別于舌部注射2×10~7個(gè)/ml細(xì)胞濃度的人舌癌細(xì)胞CAL27、SCC9及SAS構(gòu)建口腔癌原位異種移植瘤模型。(3)每日觀察,確定原位腫瘤形成時(shí)間;腫瘤形成后隔日測(cè)量原位腫瘤體積,評(píng)估移植瘤體內(nèi)生長(zhǎng)速度。(4)舌組織HE染色判定原位腫瘤形成情況,免疫組化增殖細(xì)胞核抗原(Ki67)染色判定腫瘤細(xì)胞體內(nèi)增殖水平。(5)下頜下淋巴結(jié)HE染色及免疫組化細(xì)胞角蛋白(CK)染色判定原位異種移植瘤模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平。(6)細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀測(cè)CAL27、SCC9及SAS三組細(xì)胞系體外增殖情況。(7)劃痕實(shí)驗(yàn)比較三組細(xì)胞體外遷移能力。(8)RT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞系中增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān)生物分子:表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase 9,MMP9)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、CD44、細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)和細(xì)胞間粘附分子1(Intercellular cell adhesion molecule 1,ICAM-1)等mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果:(1)使用CAL27、SCC9、SAS細(xì)胞成功構(gòu)建口腔癌原位異種移植瘤模型。當(dāng)注射細(xì)胞濃度為2×10~7個(gè)/ml時(shí),三組細(xì)胞誘導(dǎo)構(gòu)建移植瘤模型成功率較高,CAL27、SAS組移植瘤模型舌部植入腫瘤細(xì)胞后約3天可見(jiàn)腫瘤形成,成瘤率100%;SCC9組移植瘤模型舌部植入腫瘤細(xì)胞后約4周可見(jiàn)腫瘤形成,成瘤率80%。(2)2×10~7個(gè)/ml細(xì)胞濃度下成功構(gòu)建原位異種移植瘤模型,三組移植瘤生長(zhǎng)速度由快到慢、原位腫瘤體積由大到小依次為SAS組、CAL27組、SCC9組。(3)三組移植瘤中Ki67陽(yáng)性細(xì)胞率由高到低依次為SAS組(65.13%±5.24%)、CAL27組(21.02%±2.50%)、SCC9組(5.24%±3.42%)(P0.05)。(4)三組細(xì)胞體外增殖情況、細(xì)胞中EGFR mRNA表達(dá)水平由高到低依次為SAS組、CAL27組、SCC9組,細(xì)胞中N-cadherin mRNA表達(dá)水平由低到高依次為SAS組、CAL27組、SCC9組,結(jié)果與移植瘤模型腫瘤增殖情況趨勢(shì)一致。(5)HE染色示三組移植瘤模型下頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平由高到低依次為SCC9組(90%)、SAS組(40%)、CAL27組(20%)(P0.01)。(6)三組移植瘤模型下頜下淋巴結(jié)中CK陽(yáng)性轉(zhuǎn)移細(xì)胞率由高到低依次為SCC9組(51.73%±17.59%)、SAS組(19.64%±9.66%)、CAL27組(8.79%±4.51%)(P0.05)。(7)三組細(xì)胞體外遷移能力、細(xì)胞中MMP9、E-cadherin mRNA的表達(dá)水平由高到低依次為SCC9組、SAS組、CAL27組,結(jié)果與三組移植瘤模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況趨勢(shì)一致。(8)三組細(xì)胞中CD44、cyclin D1和ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平與三組細(xì)胞構(gòu)建的移植瘤模型腫瘤增殖及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移水平趨勢(shì)無(wú)明顯相關(guān)性。結(jié)論:(1)CAL27、SAS細(xì)胞構(gòu)建的原位異種移植瘤裸鼠模型腫瘤生長(zhǎng)速度快,成瘤時(shí)間短,適合需要快速建模,探討原發(fā)腫瘤增殖的研究使用。(2)SCC9細(xì)胞構(gòu)建的原位異種移植瘤模型淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成功率高,更適用于腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的研究。(3)CAL27、SCC9、SAS三種口腔癌原位異種移植瘤模型中,移植瘤增殖水平可能與口腔癌細(xì)胞體外增殖水平、細(xì)胞系中EGFR mRNA的高表達(dá)、N-cadherin mRNA的低表達(dá)有關(guān);細(xì)胞體外遷移能力、細(xì)胞中MMP9、E-cadherin mRNA的表達(dá)水平可能對(duì)原位移植瘤模型的淋巴道轉(zhuǎn)移有較強(qiáng)影響。
【圖文】：

圖 2-1 HE（100×）染色示 CAL27、SCC9 和 SAS 細(xì)胞 2×107個(gè)/ml 組舌部移植瘤形成，周?chē)〗M織排列紊亂。Fig 2-1 HE staining (100×) uncovered orthotopic tongue tumor masses formation in groups CAL27,SCC9, and SAS at 2×107/ml cell concentration, and the surrounding muscle tissue was disordered.2.2 CAL27、SCC9 和 SAS 三組口腔癌原位異種移植瘤模型腫瘤增殖情況比較為進(jìn)一步研究 CAL27、SCC9 和 SAS 三組移植瘤模型原位腫瘤增殖情況的差異，我們?cè)?2×107個(gè)/ml 細(xì)胞濃度下構(gòu)建原位移植瘤模型，比較三組移植瘤生長(zhǎng)情況及細(xì)胞體內(nèi)增殖情況。裸鼠舌部移植瘤形成后 1、3、5、7、9 天測(cè)量三組腫瘤體積并進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，從腫瘤形成后第 3 天開(kāi)始，CAL27 組（5.05±2.43）和 SASCAL27 SCC9SAS

25圖 2-2 CAL27、SCC9、SAS 細(xì)胞誘導(dǎo)的移植瘤生長(zhǎng)情況比較。Fig 2-2 A comparison of tumor growth of CAL27-, SCC9-, and SAS-induced primary tu（A）原位注射 CAL27、SCC9、SAS 細(xì)胞成功誘導(dǎo)裸鼠舌部移植瘤形成，成瘤后第 9 天大體瘤大小 SAS 組>CAL27 組>SCC9 組；（B）成瘤后每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤體積，自成瘤后第三天組和 CAL27 組移植瘤與 SCC9 組相比明顯增大，，SAS 組移植瘤稍大于 CAL27 組。**P <處死裸鼠后取舌組織做 HE 染色判定腫瘤形成，結(jié)果顯示，肉眼物形成的 CAL27、SCC9、SAS 三組裸鼠舌組織 HE 染色均顯示為腫瘤2-3）。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R739.8

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本文編號(hào)：2648741