【摘要】：背景:唾液腺是外分泌腺體,其分泌的唾液有濕潤(rùn)口腔,促進(jìn)消化的作用,其次,對(duì)于味覺,語(yǔ)言,齲齒的預(yù)防均有著密切的關(guān)系�？诟墒怯煽陀^涎液分泌量減少導(dǎo)致的一種主觀感覺,常因惡性腫瘤放療以及自身免疫系統(tǒng)疾病(Sjogren' s syndrome,SS)等引起。目前臨床上只是針對(duì)口干這一主觀感受來對(duì)癥治療,卻不能從根本上解除病人的痛苦。近年來,細(xì)胞療法和組織工程的興起為口干癥的治療帶來曙光,脂肪干細(xì)胞作為一種可能的種子細(xì)胞也受到人們的關(guān)注,本文將探討將大鼠脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腺泡樣細(xì)胞的可行性。目的:體外培養(yǎng)大鼠脂肪來源干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),并探究其在下頜下腺細(xì)胞(submandubular gland cells,SMGCs)裂解液模擬的微環(huán)境體外實(shí)驗(yàn)中,是否具有轉(zhuǎn)化為有分泌功能的腺泡樣細(xì)胞的能力,可否作為一種可供選擇的種子細(xì)胞應(yīng)用在涎腺組織工程中。方法:在無(wú)菌環(huán)境中獲得3周齡清潔級(jí)SD大鼠腹股溝處皮下脂肪帶,提取ADSCs并傳代,應(yīng)用倒置相差顯微鏡,HE染色來查看細(xì)胞的形態(tài),CCK8法檢測(cè)并據(jù)此做生長(zhǎng)曲線折線圖,成骨誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)鑒定其是否能向骨組織,脂肪組織分化。制備下頜下腺細(xì)胞裂解液,將第三代脂肪來源干細(xì)胞分為對(duì)照組與試驗(yàn)組。對(duì)試驗(yàn)組施加下頜下腺細(xì)胞裂解液干預(yù),每次換液時(shí)進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察;對(duì)對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行CK8及α-Amylase免疫熒光染色,并用淀粉酶檢測(cè)試劑盒檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組分別在第7天,14天,21天時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)液上清液內(nèi)淀粉酶的含量,分析轉(zhuǎn)化效率。結(jié)果:成功提取SD大鼠腹股溝處皮下的ADSCs:原代細(xì)胞24 h后半量換液,可貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞的數(shù)量較少,多為扁圓形,大部分細(xì)胞不貼壁,在換液時(shí)即可被去除,48 h后貼壁的細(xì)胞數(shù)量變多,形狀變?yōu)椴灰?guī)則,4天后形態(tài)逐漸一致,呈多角形或梭型,排列較為疏松,在傳代后細(xì)胞形狀呈長(zhǎng)梭型,分布方向規(guī)律,如同漩渦。傳代之后,細(xì)胞開始迅速生長(zhǎng),約2-3天即可傳代,再次傳代時(shí)形態(tài)無(wú)明顯變化。HE染色后,胞核為藍(lán)色并且胞核飽滿,胞質(zhì)被染為紅色,形狀規(guī)則,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭型。通過CCK8法測(cè)OD值并繪制ADSCs成長(zhǎng)曲線,可見細(xì)胞生長(zhǎng)整體呈”S”型,與以往文獻(xiàn)結(jié)論一致。提取的ADSCs成脂誘導(dǎo)后,在第21天進(jìn)行檢測(cè)時(shí)呈現(xiàn)大量大小不等的脂滴,被油紅”O(jiān)”染成紅色;成骨誘導(dǎo)后,在第14天左右可出現(xiàn)不透光區(qū)域即所謂的”鈣結(jié)節(jié)”,堿性磷酸酶檢測(cè)細(xì)胞胞質(zhì)呈深棕色,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則。成功誘導(dǎo)ADSCs轉(zhuǎn)分化為具有分泌功能的涎腺腺泡樣細(xì)胞:隨著誘導(dǎo)天數(shù)逐漸增加,呈長(zhǎng)梭型的細(xì)胞逐漸發(fā)生變化,呈多角形或”鵝卵石狀”細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)類似脂滴的分泌小泡,但與之前比較,數(shù)目更多,體積更小。免疫組化分析誘導(dǎo)完成后的細(xì)胞α-Amylase抗體及Cytokeratin-8檢測(cè)陽(yáng)性,而對(duì)照組呈陰性。用大鼠淀粉酶(AMY)酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)誘導(dǎo)組細(xì)胞上清液進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間推移,脂肪來源干細(xì)胞轉(zhuǎn)化率不斷提高,但轉(zhuǎn)化的速度不斷降低。結(jié)論:具有多向分化能力的大鼠原代ADSCs細(xì)胞可通過酶消化獲得,并可傳代培養(yǎng)。脂肪來源的干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為分泌α-淀粉酶功能的腺泡樣細(xì)胞,其轉(zhuǎn)化效率隨時(shí)間逐漸增加。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2646306