【摘要】：齲病和牙周病是人類最常見的感染性疾病。齲病是一種發(fā)生在牙體硬組織的慢性感染性疾病,變異鏈球菌(Streptococcus mutans, S. mutans)和表兄鏈球菌(Streptococcus sobrinus, S. sobrinus)在齲齒中的檢出率最高,被認(rèn)為是最主要的致齲菌,能夠利用糖產(chǎn)酸溶解牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)中的無機(jī)物,因此齲病以硬組織脫礦、齲洞形成為主要特征。牙周病以牙齦炎癥、牙周袋形成、牙槽骨吸收和牙齒松動為主要特征,流行病學(xué)研究表明牙周病與很多全身系統(tǒng)性疾病關(guān)系密切,這些系統(tǒng)性疾病包括：心血管疾病,胃炎及胃癌,艾滋病,早產(chǎn)低出生體重兒,糖尿病,呼吸道感染和骨質(zhì)疏松癥,得出牙周病是多種系統(tǒng)性疾病的危險(xiǎn)因素之一的結(jié)論并不為過。細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)增多、直接感染、細(xì)菌抗原和自身抗原之間的交叉反應(yīng)性／分子擬態(tài)能夠引起系統(tǒng)性疾病,有報(bào)道,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis)其發(fā)展密切相關(guān)。而且,已經(jīng)在心臟瓣膜病變、粥樣斑塊、早產(chǎn)高危孕婦的羊膜液以及早產(chǎn)孕婦的胎盤中檢測到P. gingivalis等牙周病相關(guān)病原菌。另一種牙周主要病原菌伴放線放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)也在除口腔外的身體其他病變部位被檢測到。盡管P.gingivalis和A. actinomycetemcomitans等牙周病相關(guān)細(xì)菌在系統(tǒng)性疾病中的作用尚不明確,但是這些細(xì)菌與全身疾病的關(guān)系這一方向值得探索。胃癌前病變(Precancerous lesions of gastric cancer, PLGC)是一個(gè)病理性概念,包括腸上皮化生(Intestinal Metaplasia, IM)和異型增生(Dysplasia, Dys),主要伴存于慢性萎縮性胃炎(Chronic Atrophic Gastritis, CAG),是從正常胃粘膜向胃癌轉(zhuǎn)化過程中的一個(gè)重要階段。這里我們主要研究齲病和牙周病及其主要病原菌與胃癌前病變的關(guān)系,并探索胃癌前病變患者口腔細(xì)菌的多樣性。 第一部分 胃癌前病變患者的人口學(xué)特征和臨床口腔狀況評估 盡管過去的幾十年來胃癌的發(fā)病率顯著降低,它仍然是世界范圍內(nèi)第二大惡性腫瘤,在西方國家更是如此。胃癌的發(fā)病原因不明,可能與多種因素,如生活習(xí)慣、飲食種類、環(huán)境因素、遺傳素質(zhì)、精神因素等有關(guān)。幽門螺桿菌是胃部最常感染的細(xì)菌也是慢性胃炎最主要的致病菌。研究提示,齦下菌斑和牙周袋很可能是幽門螺桿菌的潛在聚集地。很多流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),自述牙齒喪失與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。牙齒喪失最常見的原因是齲病或牙周疾病,在年輕人群中前者較多,對于年齡較長的人群,后者所占比重較大。但是盡管牙齒喪失在一定程度上是衡量牙周疾病的一個(gè)重要指標(biāo),它仍然不能作為一種直接的手段,我們需要牙周病的臨床和微生物學(xué)指標(biāo)以及牙齒脫落的病史等相關(guān)信息來探討胃癌與其之間的關(guān)系。本部分研究從年齡、性別、種族、受教育程度、收入水平、婚姻狀況和身高體重指數(shù)BMI等方面,評估研究人群的胃癌的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素和口腔健康狀況之間的關(guān)系。 方法：本實(shí)驗(yàn)選取New York Harbor Healthcare System (VANYHHS)和Bellevue Hospital Center胃腸科2009年3月30日至2011年4月27日之間,約定進(jìn)行上消化道內(nèi)窺鏡檢查的98名應(yīng)試者。研究對象納入標(biāo)準(zhǔn)為：30歲以上,無食管癌、胃癌、胃靜脈曲張或門靜脈高壓性胃病。按病理診斷結(jié)果,將研究對象分為兩組：對照組無任何癥狀或僅有淺表性胃炎；病例組患有胃癌前病變(包括慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生或異型增生)�？谇粰z查時(shí)進(jìn)行齲病和牙周病的臨床狀況評估。SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析病例組和對照組人群的胃癌的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)風(fēng)險(xiǎn)因素。 結(jié)果：胃癌前病變患者的齲病相關(guān)臨床指標(biāo)與對照組未見顯著性差異。與健康對照組相比,胃癌前病變患者的牙周健康狀況較差,病例組的牙周袋深度(Pocket depth, PD)的均值、附著喪失(Loss of attachment, LOA)均值、PD≥4mm的位點(diǎn)數(shù)所占的百分比、LOA≥3mm和LOA≥5mm的位點(diǎn)數(shù)所占的百分比以及探診出血的位點(diǎn)數(shù)所占的百分比等所有牙周臨床檢查指標(biāo)均高于對照組。 結(jié)論：胃癌前病變患者的牙周健康狀況較差,齲病相關(guān)臨床指標(biāo)與健康對照組未見顯著差異。 第二部分 胃癌前病變患者口腔中齲病和牙周病相關(guān)細(xì)菌的研究 有研究報(bào)道,慢性炎癥是疾病進(jìn)展初期的主要原因,由于牙周致病菌感染可以導(dǎo)致慢性系統(tǒng)性炎癥,而后者又是胃癌發(fā)展過程中的重要的危險(xiǎn)因素,我們推測,牙周主要致病菌的存在增加了胃癌發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)。為了驗(yàn)證此假說,我們進(jìn)行了一項(xiàng)臨床探索性的病例-對照研究,通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測唾液以及牙菌斑樣本中的四種牙周病相關(guān)主要致病菌：牙齦卟啉單胞菌(Pg)；福賽斯坦納菌(Tannerella forsythensis, Tf);牙密螺旋體(Treponema denticola, Td);伴放線放線桿菌(Aa)；兩種齲病相關(guān)主要致病菌：變異鏈球菌(Sm)和表兄鏈球菌(Sb)。結(jié)合臨床相關(guān)指標(biāo)以及患者的人口統(tǒng)計(jì)學(xué)胃癌風(fēng)險(xiǎn)因子,探索口腔感染性疾病與胃癌的發(fā)生發(fā)展是否存在一定的相關(guān)性。 方法：研究對象同第一部分�？谇粰z查時(shí)采集唾液和牙菌斑樣本,MasterPure DNA純化試劑盒提取樣本的細(xì)菌基因組DNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測樣本中的特異性細(xì)菌。以特異性細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA作為陽性對照,以滅菌水作為陰性對照,通過標(biāo)準(zhǔn)DNA產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣本中的目標(biāo)細(xì)菌進(jìn)行絕對定量。SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件行臨床指標(biāo)、風(fēng)險(xiǎn)因素以及微生物水平之間的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果：研究人群唾液中牙周主要致病菌的DNA水平與牙菌斑中的DNA水平呈正相關(guān)。Pg, Td和Tf檢出陽性的人群,平均牙周袋深度顯著大于檢出陰性的人群,中重度牙周袋(PD4mm)和探診出血的位點(diǎn)數(shù)也顯著高于陰性人群。Pg、Td和Tf的DNA水平與牙周袋深度顯著相關(guān),其中Pg和Td的DNA水平還與被測人群的中重度牙周袋和探診出血的位點(diǎn)數(shù)密切相關(guān)。齲病和牙周病主要致病菌的檢出率,在胃癌前病變患者和健康對照組兩組間有所不同。胃癌前病變患者的牙周病主要病原菌Pg和Td的陽性率高于對照組,唾液和齦下菌斑中四種牙周病原菌的DNA水平也略高于對照組,但統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。 結(jié)論：Pg、Tf、Td三者與牙周病的臨床指標(biāo),尤其是牙周袋深度和探診出血密切相關(guān)。與健康對照組相比,胃癌前病變患者Pg和Td的陽性檢出率較高,四種牙周病原菌的DNA水平也較高。 第三部分 胃癌前病變患者口腔細(xì)菌多樣性的研究 口腔中的微生物群體是目前所知的最為復(fù)雜的微生物群落之一。隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的提高,目前已明確鑒別出口腔細(xì)菌群落或生物膜中包含至少500種微生物�？谇贿@一眾多微生物棲息的場所,對于人類健康和疾病都有著至關(guān)重要的意義�？谇皇窍赖拈_端,常常被成為"inner outside",解剖學(xué)上講消化道由連續(xù)的器官構(gòu)成,胃也屬于消化系統(tǒng),口腔和胃的微生物在某種程度上能夠互相影響。一方面,口腔中的細(xì)菌可以通過攝入食物被帶入胃內(nèi),另一方面,口腔菌群也有可能受到胃部疾病影響。例如,有些胃癌患者會伴發(fā)胃食管返流疾病(Gastroesophageal Reflux Disease, GERD),返流物能夠造成上消化道系統(tǒng)的相應(yīng)病變,改變其正常細(xì)菌群落,若發(fā)生嘔吐癥狀,還可影響到口腔。因此,我們推測,胃癌前病變患者的口腔細(xì)菌多樣性與健康人群不同。本研究采用聚合酶鏈反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳分析技術(shù)(polymerase chain reaction-based denaturing gradient gel electrophoresis technique, PCR-DGGE)作為手段分析胃癌前病變患者口腔中唾液和牙菌斑樣本的細(xì)菌多樣性,同時(shí)分析牙周病原菌的存在對口腔細(xì)菌多樣性的影響。 方法：研究對象同第一部分。唾液和牙菌斑樣本DNA的提取同第二部分。采用GeneAmp PCR SystemTM 9700進(jìn)行巢式PCR。制備變形梯度凝膠,PCR產(chǎn)物和特異性DGGE參考Maker上樣,在pH 8.5溫度為58℃的1×Tris-acetate-EDTA (TAE)電泳緩沖液中恒壓60 V電泳17小時(shí)。電泳結(jié)束后取下凝膠,在0.5μg/mL的EB溶液中染色12分鐘,蒸餾水中漂洗6分鐘后,AlphalmagerTM 3300 System采集DGGE圖像,BioNumerics軟件分析圖像,SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析微生物學(xué)指標(biāo)和細(xì)菌多樣性之間的相關(guān)性。 結(jié)果：胃癌前病變患者的齦下菌斑樣本的DGGE條帶數(shù)為35.6,顯著高于對照組的33.2(p0.05),但兩組間唾液樣本的DGGE條帶數(shù)量,未見顯著性差異。整體研究人群的6個(gè)不同牙位點(diǎn)齦下菌斑之間的相似性達(dá)80.7%,而唾液和齦下菌斑的相似性只有78.0%。病例組唾液樣本和齦下菌斑樣本的相似程度(76.5%)略低于健康對照組(78.6)；病例組不同牙位齦下菌斑樣本之間的相似程度卻比對照組略高。不同牙位齦下菌斑之間的相似性越高,齦下菌斑樣本的細(xì)菌多樣性越高(p0.001)。牙周病原菌在多牙位(≥2)檢出陽性的人群,唾液樣本DGGE條帶數(shù)低于只有一個(gè)牙位檢出陽性或全部牙位檢出陰性的人群,齦下菌斑的多樣性情況與此相反,Pg, Td和Tf多牙位檢出陽性的人群,齦下菌斑的DGGE條帶數(shù)均高于只有一個(gè)牙位檢出陽性或全部牙位檢出陰性的人群的人群。 結(jié)論：胃癌前病變患者口腔中齦下菌斑的細(xì)菌多樣性略高于健康人群,同種來源樣本(不同牙位齦下菌斑)細(xì)菌多樣性的相似程度高于不同來源樣本(唾液和齦下菌斑)。齦下菌斑的細(xì)菌多樣性和各牙位齦下菌斑相似性高度相關(guān)。牙周病原菌在多位點(diǎn)檢出陽性的人群,唾液細(xì)菌多樣性有所下降,而齦下菌斑細(xì)菌多樣性有所升高。
【圖文】：

075已O卜一~，}圖3一 3CT值圖譜(A)、標(biāo)準(zhǔn)曲線(B)和溶解曲線圖譜(C)(以Pg為例) F193一 3CTvalue， standardeurveandmeltingeurveofreal一 timeqPCR(takePg省sexamPle)討論實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，是在傳統(tǒng)定量PCR的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種先進(jìn)的核酸定量方法，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程，使每一個(gè)循環(huán)變得“可見”，最后通過CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品中的DNA(或cDNA)的起始濃度進(jìn)行定量的方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或eDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準(zhǔn)確的方法 (Balajeeeta一，2007)。實(shí)時(shí)定量PeR的基本原理是:擴(kuò)增呈指數(shù)增長，在反應(yīng)體系和條件完全致的情況下，樣本DNA含量與擴(kuò)增產(chǎn)物的對數(shù)成正比

在PCR產(chǎn)物中加入10x上樣緩沖液，在1.5%瓊脂糖凝膠中60V電泳1小時(shí)，染色、漂洗，凝膠成像系統(tǒng)拍照。8.統(tǒng)計(jì)分析采用optieonMonitorReal一TimeAnalysis50伽are2.0分析軟件對實(shí)時(shí)定量pCR的結(jié)果進(jìn)行分析，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPssl7.0分析實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)，Chi一Square(才)檢驗(yàn)比較不同細(xì)菌的分布情況，Kruskal一WalhS非參數(shù)檢驗(yàn)比較不同組別DNA水平的差異，P值小于0.05，則認(rèn)為有顯著性差異。結(jié)果一PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果唾液和牙菌斑樣本PCR均與預(yù)期結(jié)果一致，，如圖4一2擴(kuò)增所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果條帶大小所示。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2642401