【摘要】：目的:探討不同濃度BMP-2及BMP-9對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響,并進(jìn)一步探討在炎性因子TNF-α加入的情況下,不同濃度的BMP-2及BMP-9所介導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的改變,初步了解在炎性條件下,BMP-2及BMP-9對(duì)于成骨分化的作用效果。材料與方法:1、細(xì)胞提取、培養(yǎng)及鑒定:采用全骨髓沖洗及差速貼壁法分離培養(yǎng)SD大鼠原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀鑒定干細(xì)胞表面標(biāo)記物,成脂及成骨分化驗(yàn)證其多向分化能力2、實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)以在誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基(Osteogenic media OM)中培養(yǎng)的大鼠BMMSCs為對(duì)照組,以在OM中加入不同濃度BMP-2、BMP-9及TNF-α為實(shí)驗(yàn)組。濃度分別設(shè)定為(1)BMP-2濃度(50、100、150ng/ml)(2)BMP-9濃度(50、100、150ng/ml)(3)TNF-α濃度(10ng/ml)(4)TNF-α(10ng/ml)+不同濃度BMP-2(50、100、150ng/ml)(5)TNF-α(10ng/ml)+不同濃度BMP-9(50、100、150ng/ml)。3、堿性磷酸酶活性檢測(cè):AKP試劑盒測(cè)定各組堿性磷酸酶活力4、鈣結(jié)節(jié)含量檢測(cè):茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)觀察各組鈣結(jié)節(jié)礦化程度。5、Real-Time PCR檢測(cè):檢測(cè)各組成骨相關(guān)指標(biāo)的ColⅠ、OCN mRNA的表達(dá)量6、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0軟件分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±s)表示,各組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P0.05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn),作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,將分析檢驗(yàn)后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 6.0進(jìn)行制圖。結(jié)果:1、細(xì)胞提取、培養(yǎng)及鑒定:經(jīng)流式細(xì)胞儀鑒定提取的干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD44、CD45的陽性表達(dá)率分別為100%、2.9%、96.5%、0.8%,茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色及油紅O成脂染色證實(shí)細(xì)胞有多向分化能力。2、ALP活性檢測(cè)結(jié)果:與對(duì)照組相比,在加入含TNF-α的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)后,在第3、5、7天各時(shí)間點(diǎn),BMMSCs堿性磷酸酶的活性顯著降低(P0.05)在加入含BMP-2及BMP-9的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)后,BMMSCs堿性磷酸酶活性有明顯提升(P0.05),并且均在BMP-2及BMP-9濃度為100ng/ml時(shí)達(dá)到峰值。且含BMP-9的培養(yǎng)液所誘導(dǎo)的BMMCs的堿性磷酸酶活性均高于同等濃度的BMP-2。在同時(shí)含有BMP-2、BMP-9及TNF-α((4)組、(5)組)的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液中,BMMSCs堿性磷酸酶活性均較同濃度僅含有BMP-2、BMP-9的誘導(dǎo)培養(yǎng)液所誘導(dǎo)的結(jié)果偏低,但高于對(duì)照組及TNF-α組(P0.05)。3.茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色結(jié)果:與對(duì)照組相比,在按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)14天后,僅含TNF-α成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液組的鈣結(jié)節(jié)含量減少(P0.05),含有BMP-2及BMP-9成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液組鈣結(jié)節(jié)含量顯著提升,且含BMP-9誘導(dǎo)培養(yǎng)液組的鈣結(jié)節(jié)含量高于同濃度的BMP-2組(P0.05),在加既含有BMP-2、BMP-9及TNF-α((4)組、(5)組)的誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)液培養(yǎng)14天后其鈣結(jié)節(jié)含量較僅含BMP-2、BMP-9組的含量降低,但依舊高于對(duì)照組及TNF-α組(P0.05)4.實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果:與對(duì)照組相比,成骨晚期相關(guān)指標(biāo)OCN的mRNA表達(dá)量,在按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度的TNF-α、BMP-2、BMP-9的成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后,僅含TNF-α組的含量遠(yuǎn)低于對(duì)照組,含有BMP-2及BMP-9組的OCN的mRNA表達(dá)量隨著濃度增加而增加,且在100ng/ml濃度時(shí)達(dá)到峰值,與濃度達(dá)到150ng/ml表達(dá)量無顯著差異(P0.05)同濃度的BMP-9所誘導(dǎo)成骨后OCN的表達(dá)量依舊高于同濃度BMP-2(P0.05)。在(4)組、(5)組濃度的誘導(dǎo)液培養(yǎng)21天后OCN的表達(dá)量與同濃度僅含BMP-2及BMP-9的培養(yǎng)液相比降低(P0.05)但高于對(duì)照組及僅含TNF-α組。Ⅰ型膠原ColⅠ的表達(dá)量呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。結(jié)論:BMP-2及BMP-9對(duì)于BMMSCs有明顯的促成骨作用,且有隨濃度增加而增加的趨勢(shì),但二者都會(huì)在其濃度達(dá)到100ng/ml時(shí)達(dá)到促成骨作用的峰值,且BMP-9的促成骨作用(ALP值、鈣結(jié)節(jié)面積、OCN及ColⅠ的表達(dá)量),均高于同濃度的BMP-2,在炎性因子TNF-α的作用下BMMSCs成骨分化受到了抑制,對(duì)于BMP-2及BMP-9所介導(dǎo)的成骨分化同樣起著抑制作用,但BMP-9依舊能在炎性因子的作用下發(fā)揮著比同濃度BMP-2更好的成骨作用。且其最佳促成骨濃度也因炎性因子的作用而上升。
【圖文】：

中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文3 結(jié)果3.1 BMMSCs 提取、培養(yǎng)初接種于培養(yǎng)皿中的的細(xì)胞成球形，與紅細(xì)胞等其他雜質(zhì)細(xì)胞無法明顯區(qū)24h 換液后細(xì)胞貼壁變形，伸出偽足，呈現(xiàn)多邊形或梭形。在第 5d 左右出現(xiàn)細(xì)落，經(jīng)過 TryPLE Express消化后傳一代后，雜質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞形態(tài)一。生長速度逐步加快，在 5d左右即可達(dá)到 80%左右的融合度。后逐步培養(yǎng)傳代，第三代 BMMSCs細(xì)胞形態(tài)統(tǒng)一，生長速度良好，約 3~4d可達(dá)到 80%融合可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)

3.3 BMMSCs 多向分化能力檢測(cè)第 3 代 BMMSCs 在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng) 7d 左右，顯微鏡下可見大小不等的結(jié)晶狀團(tuán)塊，即為早期形成的鈣化結(jié)節(jié)或其分泌基質(zhì)，，在培養(yǎng)至第 14d 結(jié)晶狀團(tuán)塊逐漸增大。在誘導(dǎo)成骨過程中 BMMSCs 增殖速度明顯減緩，換液的過程中見有少量結(jié)節(jié)脫落漂浮于培養(yǎng)基之中。經(jīng)異丙醇固定及茜素紅 S 染色液染色后，可見明顯的被染成紅色的鈣化結(jié)節(jié)（如圖 3）。第 3代 BMMSCs更換誘導(dǎo)成脂培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)后，細(xì)胞形態(tài)逐步發(fā)生改變，生長速度緩慢并在換液過程中少量細(xì)胞漂浮，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)逐步出現(xiàn)類似液滴狀結(jié)構(gòu)，此為脂肪細(xì)胞的脂滴。在誘導(dǎo) 14d 后多聚甲醛固定異丙醇清洗后，油紅 O染色脂滴觀察到脂肪滴被染成橙紅色（如圖 4）圖 2. BMMSCs 表面標(biāo)記物流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2642231