發(fā)布時(shí)間：2020-04-26 17:52

【摘要】：摘要 第一章檳榔堿對(duì)原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及DNA損傷作用的影響 目的：研究檳榔堿對(duì)原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖、凋亡及DNA損傷作用的影響。 方法：體外培養(yǎng)、擴(kuò)增口腔粘膜上皮和成纖維細(xì)胞,通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)及角蛋白和波形絲蛋白免疫組織化學(xué)染色等鑒定細(xì)胞；MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)高濃度檳榔堿短時(shí)間干預(yù)及低濃度檳榔堿長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析檳榔堿干預(yù)對(duì)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響；彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)檳榔堿對(duì)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞DNA損傷的影響。 結(jié)果：所培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞形態(tài),角蛋白和波形絲蛋白染色陽(yáng)性。高濃度(0.2mM-0.8mM)檳榔堿短期(0-72小時(shí))作用于上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞后,上皮細(xì)胞隨檳榔堿濃度的增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)而活力下降,形態(tài)變化明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；成纖維細(xì)胞在檳榔堿作用后活力下降不明顯及形態(tài)無(wú)明顯改變,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。在對(duì)細(xì)胞周期影響方面,0.8mmM檳榔堿干預(yù)48小時(shí)導(dǎo)致了上皮細(xì)胞位于G2/M期的比例相比對(duì)照組明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而對(duì)成纖維細(xì)胞周期的改變影響不明顯,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。0.6mM檳榔堿干預(yù)24小時(shí)可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,呈現(xiàn)劑量和時(shí)間的依賴性,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；但誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡作用不明顯,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。低濃度檳榔堿顯著抑制上皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件是0.1mM作用12天后,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；此濃度檳榔堿干預(yù)相同時(shí)間對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)影響無(wú)明顯影響,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。各濃度檳榔堿作用成纖維細(xì)胞24小時(shí)后,成纖維細(xì)胞DNA損傷情況與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；上皮細(xì)胞DNA損傷情況與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且與濃度呈依賴關(guān)系,濃度越高,DNA損傷越嚴(yán)重。 結(jié)論： 1、高濃度檳榔堿短時(shí)間干預(yù)能夠抑制上皮細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,細(xì)胞周期在G2/M期發(fā)生阻滯,對(duì)DNA損傷作用呈劑效依賴關(guān)系。 2、高濃度檳榔堿短時(shí)間干預(yù)對(duì)成纖維細(xì)胞增殖,凋亡及DNA損傷均無(wú)明顯影響。 3、低濃度檳榔堿干預(yù)到第12天后上皮細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)明顯下降,而成纖維細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯改變。 第二章檳榔堿對(duì)口腔粘膜上皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響及其信號(hào)通路機(jī)制研究 目的：探討檳榔堿對(duì)口腔粘膜上皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)的影響及其可能機(jī)制。 方法：應(yīng)用Western blotting、RT-PCR和明膠酶譜法,檢測(cè)高濃度檳榔堿(0.2mM-0.8mM)分別短時(shí)間(10分鐘)和低濃度檳榔堿(0.1mM)長(zhǎng)時(shí)間(24小時(shí))處理口腔粘膜上皮細(xì)胞后MMP-2的表達(dá)。在O.1mM檳榔堿干預(yù)上皮細(xì)胞檢測(cè)MMP-2表達(dá)前,用ERK、PI3K、 p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信號(hào)通路抑制劑PD98059,LY294002,U0126,N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC), SB203580,SP600125和Bayl1-7082分別預(yù)處理口腔粘膜上皮細(xì)胞,揭示檳榔堿影響上皮細(xì)胞MMP-2表達(dá)的信號(hào)通路機(jī)制。 結(jié)果：高濃度檳榔堿(0.2mM-0.8mM)分別短時(shí)間(10分鐘)處理口腔粘膜上皮細(xì)胞后,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí),與對(duì)照組相比MMP-2表達(dá)顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且與檳榔堿具有濃度依賴性。低濃度檳榔堿(0.1mM)長(zhǎng)時(shí)間(24小時(shí))處理口腔粘膜上皮細(xì)胞后,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),MMP-2表達(dá)顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。P13K信號(hào)通路抑制劑LY294002能夠抑制低濃度(O.1mM)檳榔堿誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)的能力,且呈濃度依賴性,而ERK信號(hào)通路抑制劑PD98059無(wú)此作用。p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信號(hào)通路抑制劑SB203580、SP600125、Bay11-7082能抑制低濃度(0.1mM)檳榔堿誘導(dǎo)MMP-2表達(dá)的能力,而NAC和U0126則無(wú)此作用。 結(jié)論： 1、高濃度或低濃度檳榔堿長(zhǎng)時(shí)間或短時(shí)間處理口腔粘膜上皮細(xì)胞都能導(dǎo)致MMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)； 2、低濃度檳榔堿長(zhǎng)時(shí)間處理口腔粘膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)MMP-2蛋白表達(dá)上調(diào)的機(jī)制可能與PI3K、p38MAPK、c-JNK和NF-κβ等信號(hào)通路有關(guān)。 第三章檳榔堿對(duì)口腔粘膜成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)影響的信號(hào)通路機(jī)制及姜黃素影響CTGF表達(dá)作用的研究 目的：觀察檳榔堿干預(yù)后口腔粘膜成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá),探討姜黃素拮抗檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)的可能機(jī)制。 方法：免疫組織化學(xué)法檢測(cè)20例口腔粘膜下纖維性變患組織中CTGF表達(dá)情況。Western blot檢測(cè)檳榔堿長(zhǎng)時(shí)間和短時(shí)間作用對(duì)口腔粘膜成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)的影響,以及使用PD98059(12.5、25、50μM)、SB203580(10μM)、SP600125(10μM)、Bay11-7082(10μM)和NAC(5mM)等信號(hào)通路抑制劑觀察檳榔堿影響CTGF表達(dá)的信號(hào)機(jī)制。使用姜黃素干預(yù)并檢測(cè)其對(duì)檳榔堿誘導(dǎo)口腔粘膜成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)上調(diào)作用的影響。 結(jié)果：CTGF在口腔粘膜下纖維性變患者口腔粘膜組織中的表達(dá)顯著高于正常粘膜組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。不同濃度檳榔堿干預(yù)成纖維細(xì)胞后,Western blot檢測(cè)結(jié)果表明檳榔堿促進(jìn)了CTGF表達(dá),且O.1mmM的檳榔堿作用2小時(shí)后CTGF蛋白增加約2.5倍。O.1mM檳榔堿作用口腔粘膜成纖維細(xì)胞不同時(shí)間后,蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果表明口腔粘膜成纖維細(xì)胞中CTGF最高表達(dá)水平發(fā)生在O.1mM檳榔堿作用2小時(shí)時(shí),此后下降。Western blot檢測(cè)不同信號(hào)通路抑制劑干預(yù)后CTGF表達(dá),結(jié)果表明Bayll-7082、SP600125、SB203580和NAC等抑制劑顯著的降低了檳榔堿誘導(dǎo)CTGF表達(dá),但PD98059無(wú)此作用。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明姜黃素提前干預(yù)口腔粘膜成纖維細(xì)胞后,檳榔堿誘導(dǎo)口腔粘膜成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)減少,且姜黃素是以劑量依賴性的方式降低檳榔堿誘導(dǎo)的CTGF的表達(dá),在姜黃素濃度達(dá)到10μM時(shí),CTGF表達(dá)水平就已經(jīng)低于正常對(duì)照組。 結(jié)論： 1、TGF在口腔粘膜下纖維性變組織中的表達(dá)顯著高于對(duì)照組。 2、檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞CTGF表達(dá)增加作用呈劑效和時(shí)效依賴性,可能與NF-kβ、JNK、p38APK信號(hào)通路有關(guān)。 3、姜黃素可以拮抗檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞CTGF的表達(dá)。
【圖文】：

A:融合度為95%左右的原代上皮

細(xì)胞貼壁完成。剛貼壁時(shí)，細(xì)胞呈短梭型或不規(guī)則多角形，48小時(shí)培養(yǎng)后，細(xì)胞^u始在水平方向向兩端展開，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，，呈螺旋狀長(zhǎng)(圖3-1B)。H幽圖3-1A:融合度為95%左右的原代上皮 圖3-1B:融合度為95?/o左右的原代成纖維細(xì)胞（X100) 細(xì)胞（X100)3.2免疫組化檢測(cè)上皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞特異性蛋白3.2.1上皮細(xì)胞角蛋白的免疫組化檢測(cè)角蛋白是上皮細(xì)胞的特異性表達(dá)蛋白，通常被用來(lái)區(qū)分上皮細(xì)胞和非上皮細(xì)胞。鏡下觀察可見，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞角蛋白染色陽(yáng)性，細(xì)胞裝均勻染成棕黃色，高倍鏡下可觀察到細(xì)絲網(wǎng)狀，蘇術(shù)精襯染核藍(lán)色(圖3-2B);空白對(duì)照組培養(yǎng)的細(xì)胞角蛋白染色陰性，蘇術(shù)精襯染核藍(lán)色(圖3-2A)。?g M “tt*務(wù) of _ 、 廔 ,粉坤海k ?. ?吟務(wù)?、 V - 、S

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