【摘要】：摘要 第一章檳榔堿對原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞增殖、凋亡及DNA損傷作用的影響 目的：研究檳榔堿對原代培養(yǎng)口腔粘膜上皮細胞和成纖維細胞增殖、凋亡及DNA損傷作用的影響。 方法：體外培養(yǎng)、擴增口腔粘膜上皮和成纖維細胞,通過細胞形態(tài)學(xué)及角蛋白和波形絲蛋白免疫組織化學(xué)染色等鑒定細胞；MTT實驗檢測高濃度檳榔堿短時間干預(yù)及低濃度檳榔堿長時間作用對上皮細胞和成纖維細胞增殖的影響；流式細胞術(shù)分析檳榔堿干預(yù)對上皮細胞和成纖維細胞的細胞周期的影響；彗星實驗檢測檳榔堿對上皮細胞和成纖維細胞DNA損傷的影響。 結(jié)果：所培養(yǎng)的細胞具有典型的上皮細胞和成纖維細胞形態(tài),角蛋白和波形絲蛋白染色陽性。高濃度(0.2mM-0.8mM)檳榔堿短期(0-72小時)作用于上皮細胞和成纖維細胞后,上皮細胞隨檳榔堿濃度的增加及作用時間延長而活力下降,形態(tài)變化明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；成纖維細胞在檳榔堿作用后活力下降不明顯及形態(tài)無明顯改變,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。在對細胞周期影響方面,0.8mmM檳榔堿干預(yù)48小時導(dǎo)致了上皮細胞位于G2/M期的比例相比對照組明顯增加,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而對成纖維細胞周期的改變影響不明顯,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。0.6mM檳榔堿干預(yù)24小時可誘導(dǎo)上皮細胞出現(xiàn)凋亡,呈現(xiàn)劑量和時間的依賴性,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；但誘導(dǎo)成纖維細胞凋亡作用不明顯,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。低濃度檳榔堿顯著抑制上皮細胞生長的條件是0.1mM作用12天后,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；此濃度檳榔堿干預(yù)相同時間對成纖維細胞生長影響無明顯影響,差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。各濃度檳榔堿作用成纖維細胞24小時后,成纖維細胞DNA損傷情況與對照組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；上皮細胞DNA損傷情況與對照組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且與濃度呈依賴關(guān)系,濃度越高,DNA損傷越嚴重。 結(jié)論： 1、高濃度檳榔堿短時間干預(yù)能夠抑制上皮細胞增殖,誘導(dǎo)上皮細胞凋亡,細胞周期在G2/M期發(fā)生阻滯,對DNA損傷作用呈劑效依賴關(guān)系。 2、高濃度檳榔堿短時間干預(yù)對成纖維細胞增殖,凋亡及DNA損傷均無明顯影響。 3、低濃度檳榔堿干預(yù)到第12天后上皮細胞活細胞數(shù)明顯下降,而成纖維細胞活細胞數(shù)無明顯改變。 第二章檳榔堿對口腔粘膜上皮細胞MMP-2表達的影響及其信號通路機制研究 目的：探討檳榔堿對口腔粘膜上皮細胞MMP-2表達的影響及其可能機制。 方法：應(yīng)用Western blotting、RT-PCR和明膠酶譜法,檢測高濃度檳榔堿(0.2mM-0.8mM)分別短時間(10分鐘)和低濃度檳榔堿(0.1mM)長時間(24小時)處理口腔粘膜上皮細胞后MMP-2的表達。在O.1mM檳榔堿干預(yù)上皮細胞檢測MMP-2表達前,用ERK、PI3K、 p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信號通路抑制劑PD98059,LY294002,U0126,N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC), SB203580,SP600125和Bayl1-7082分別預(yù)處理口腔粘膜上皮細胞,揭示檳榔堿影響上皮細胞MMP-2表達的信號通路機制。 結(jié)果：高濃度檳榔堿(0.2mM-0.8mM)分別短時間(10分鐘)處理口腔粘膜上皮細胞后,細胞繼續(xù)培養(yǎng)12小時,與對照組相比MMP-2表達顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),且與檳榔堿具有濃度依賴性。低濃度檳榔堿(0.1mM)長時間(24小時)處理口腔粘膜上皮細胞后,細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,MMP-2表達顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。P13K信號通路抑制劑LY294002能夠抑制低濃度(O.1mM)檳榔堿誘導(dǎo)MMP-2表達的能力,且呈濃度依賴性,而ERK信號通路抑制劑PD98059無此作用。p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信號通路抑制劑SB203580、SP600125、Bay11-7082能抑制低濃度(0.1mM)檳榔堿誘導(dǎo)MMP-2表達的能力,而NAC和U0126則無此作用。 結(jié)論： 1、高濃度或低濃度檳榔堿長時間或短時間處理口腔粘膜上皮細胞都能導(dǎo)致MMP-2蛋白表達上調(diào)； 2、低濃度檳榔堿長時間處理口腔粘膜上皮細胞誘導(dǎo)MMP-2蛋白表達上調(diào)的機制可能與PI3K、p38MAPK、c-JNK和NF-κβ等信號通路有關(guān)。 第三章檳榔堿對口腔粘膜成纖維細胞CTGF表達影響的信號通路機制及姜黃素影響CTGF表達作用的研究 目的：觀察檳榔堿干預(yù)后口腔粘膜成纖維細胞CTGF的表達,探討姜黃素拮抗檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細胞CTGF表達的可能機制。 方法：免疫組織化學(xué)法檢測20例口腔粘膜下纖維性變患組織中CTGF表達情況。Western blot檢測檳榔堿長時間和短時間作用對口腔粘膜成纖維細胞CTGF表達的影響,以及使用PD98059(12.5、25、50μM)、SB203580(10μM)、SP600125(10μM)、Bay11-7082(10μM)和NAC(5mM)等信號通路抑制劑觀察檳榔堿影響CTGF表達的信號機制。使用姜黃素干預(yù)并檢測其對檳榔堿誘導(dǎo)口腔粘膜成纖維細胞CTGF表達上調(diào)作用的影響。 結(jié)果：CTGF在口腔粘膜下纖維性變患者口腔粘膜組織中的表達顯著高于正常粘膜組織,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。不同濃度檳榔堿干預(yù)成纖維細胞后,Western blot檢測結(jié)果表明檳榔堿促進了CTGF表達,且O.1mmM的檳榔堿作用2小時后CTGF蛋白增加約2.5倍。O.1mM檳榔堿作用口腔粘膜成纖維細胞不同時間后,蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果表明口腔粘膜成纖維細胞中CTGF最高表達水平發(fā)生在O.1mM檳榔堿作用2小時時,此后下降。Western blot檢測不同信號通路抑制劑干預(yù)后CTGF表達,結(jié)果表明Bayll-7082、SP600125、SB203580和NAC等抑制劑顯著的降低了檳榔堿誘導(dǎo)CTGF表達,但PD98059無此作用。蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果表明姜黃素提前干預(yù)口腔粘膜成纖維細胞后,檳榔堿誘導(dǎo)口腔粘膜成纖維細胞CTGF表達減少,且姜黃素是以劑量依賴性的方式降低檳榔堿誘導(dǎo)的CTGF的表達,在姜黃素濃度達到10μM時,CTGF表達水平就已經(jīng)低于正常對照組。 結(jié)論： 1、TGF在口腔粘膜下纖維性變組織中的表達顯著高于對照組。 2、檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細胞CTGF表達增加作用呈劑效和時效依賴性,可能與NF-kβ、JNK、p38APK信號通路有關(guān)。 3、姜黃素可以拮抗檳榔堿誘導(dǎo)成纖維細胞CTGF的表達。
【圖文】：

A:融合度為95%左右的原代上皮

細胞貼壁完成。剛貼壁時，細胞呈短梭型或不規(guī)則多角形，48小時培養(yǎng)后，細胞^u始在水平方向向兩端展開，形態(tài)逐漸變?yōu)殚L梭形，，呈螺旋狀長(圖3-1B)。H幽圖3-1A:融合度為95%左右的原代上皮 圖3-1B:融合度為95?/o左右的原代成纖維細胞（X100) 細胞（X100)3.2免疫組化檢測上皮細胞及成纖維細胞特異性蛋白3.2.1上皮細胞角蛋白的免疫組化檢測角蛋白是上皮細胞的特異性表達蛋白，通常被用來區(qū)分上皮細胞和非上皮細胞。鏡下觀察可見，實驗組細胞角蛋白染色陽性，細胞裝均勻染成棕黃色，高倍鏡下可觀察到細絲網(wǎng)狀，蘇術(shù)精襯染核藍色(圖3-2B);空白對照組培養(yǎng)的細胞角蛋白染色陰性，蘇術(shù)精襯染核藍色(圖3-2A)。?g M “tt*務(wù) of _ 、 廔 ,粉坤海k ?. ?吟務(wù)?、 V - 、S

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