【摘要】：目的:顳下頜關(guān)節(jié)(Temporomandibular joint,TMJ)盤結(jié)構(gòu)改變是由非炎癥起源代償重塑組織功能失調(diào)引起繼發(fā)炎癥致組織結(jié)構(gòu)破壞所導(dǎo)致。本實(shí)驗(yàn)采用脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作用于山羊顳下頜關(guān)節(jié)盤細(xì)胞,對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞進(jìn)行炎癥誘導(dǎo),探索炎癥環(huán)境對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的影響。探究白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)在炎癥反應(yīng)中的作用,以及IL-1β對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的影響。方法:一、LPS濃度篩選實(shí)驗(yàn):體外分離山羊TMJ關(guān)節(jié)盤組織,培養(yǎng)山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞。使用MTT檢測不同濃度LPS(0、0.1、1、10、100μg/mL)對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖的影響。臺盼藍(lán)染色觀察山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的存活狀態(tài)。使用qRT-PCR檢測各濃度組中IL-1β的表達(dá)水平。運(yùn)用ELISA檢測IL-6、TNF-α的分泌水平。在甲苯胺藍(lán)、天狼星紅染色后觀察加藥后山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖、總膠原表達(dá)情況。二、IL-1β作用于山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)驗(yàn):按照實(shí)驗(yàn)要求將實(shí)驗(yàn)組分為:空白對照組、加LPS(10μg/mL)培養(yǎng)組、加IL-1β(10ng/mL)培養(yǎng)組、加LPS(10μg/mL)+IL-1β(10ng/mL)培養(yǎng)組,MTT檢測各組對山羊TMJ盤細(xì)胞增殖能力的影響。通過ELISA檢測各實(shí)驗(yàn)組中IL-6、TNF-α的分泌水平。利用甲苯胺藍(lán)、天狼星紅和I型膠原免疫組化染色觀察各組中山羊TMJ盤細(xì)胞外基質(zhì)中糖胺聚糖、總膠原以及I型膠原的表達(dá)情況。通過qRT-PCR檢測各組中相關(guān)基因mRNA的表達(dá)情況。結(jié)果:鏡下觀察山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)呈長梭形。I型膠原免疫組化染色、甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果示陽性。MTT結(jié)果示,相比對照組不同濃度的LPS作用于細(xì)胞24h后均對其增殖能力有抑制(p0.05)。作用24h后,LPS(10μg/mL)相比對照組細(xì)胞活性下降較多。臺盼藍(lán)染色結(jié)果顯示LPS(10μg/mL)組細(xì)胞胞膜有部分透藍(lán),胞膜連續(xù)性下降,細(xì)胞碎散,大部分細(xì)胞存活。小濃度LPS(0、5、10、15μg/mL)MTT檢測示24h后LPS對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖抑制依賴劑量增長。qRT-PCR示相比對照組,三個實(shí)驗(yàn)組中IL-1βmRNA的表達(dá)水平均上調(diào)(p0.05)。ELISA檢測示相較于對照組,LPS(10μg/mL)組IL-6、TNF-α的分泌水平呈明顯的上升(p0.05)。甲苯胺藍(lán)和天狼星紅染色顯示相比對照組LPS(10μg/mL)組陽性結(jié)果明顯。綜上所述,選擇LPS(10μg/mL)作用24h作為適宜的實(shí)驗(yàn)濃度和時間。LPS、IL-1β分別作用于山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞,相比對照組LPS+IL-1β組細(xì)胞活性明顯下降。三個實(shí)驗(yàn)組均對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞增殖存在抑制(p0.05)。ELISA檢測示LPS組、LPS+IL-1β組較對照組中IL-6、TNF-α分泌水平上升顯著(p0.05)。甲苯胺藍(lán)染色、天狼星紅染色、I型膠原免疫組化染色示:相比對照組LPS+IL-1β組染色陽性表達(dá)減少。qRT-PCR示與對照組相比LPS+IL-1β組Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平下降。LPS+IL-1β組Aggrecan蛋白的表達(dá)與對照組相比下降。與對照組相比LPS+IL-1β組MMP-1、MMP-3和MMP-13表達(dá)水平均明顯上調(diào)(p0.05)。結(jié)論:1、LPS誘導(dǎo)炎癥后可產(chǎn)生IL-1β和其他炎癥因子,且炎癥反應(yīng)對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞形態(tài)、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白有影響作用。2、IL-1β與LPS共同作用對山羊TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)中膠原蛋白及蛋白聚糖的表達(dá)有抑制作用,并促進(jìn)炎癥反應(yīng)過程中MMP-1、MMP-3以及MMP-13的表達(dá)。
【圖文】：

使用 PrimeScriptTMRT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 試劑盒檢測 IL-1β mRNA 表達(dá)。2.3.8 結(jié)果處理采用 SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 mean ±S.D.形式表示，多組數(shù)據(jù)使用單因素方差分析（ANOVA），各組間數(shù)據(jù)差異比較采用 LSD 檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)間使用配對 t 檢驗(yàn)。*表示 p<0.05，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，檢驗(yàn)水平α=0.05。2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果2.4.1 細(xì)胞形態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)：鏡下可見細(xì)胞呈長梭形，山羊 TMJ 關(guān)節(jié)盤細(xì)胞以成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞為主。I 型膠原免疫組化染色和甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果呈陽性，提示山羊 TMJ關(guān)節(jié)盤細(xì)胞 ECM 存在 I 型膠原和 GAG 蛋白。

Fig. 1 Culture and observation of goat TMJ disc cells2.4.2 MTT 檢測 LPS 誘導(dǎo)對山羊 TMJ 盤細(xì)胞增殖的影響LPS(100μg/mL)組在加藥 24 小時后細(xì)胞存活率為 60.861%，LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)組分別為 95.611%和 93.253%，，LPS(10μg/mL)組作用細(xì)胞后 24 小時細(xì)胞相對存活率為 84.092%。相比對照組，LPS 誘導(dǎo) 24h 后各組細(xì)胞相對活力均有下降，提示 LPS 給藥后會抑制細(xì)胞活力。LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)兩組與對照組相比，細(xì)胞活性下降不明顯，組間差異小。LPS(10μg/mL)組相比對照組細(xì)胞活性下降較多。LPS(100μg/mL)組相比對照組細(xì)胞活性下降明顯，與LPS(10μg/mL)組相比差異明顯。在給藥 48 后 LPS(0.1μg/mL)、LPS(1μg/mL)兩組相比對照組細(xì)胞活性仍有所下降，但分別與 72h、96h、120h 時兩組的細(xì)胞活力對比，后面三個時間點(diǎn)兩組細(xì)胞活力有所上升。24h 時 LPS(10μg/mL)組相比其他時間點(diǎn)該組的細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢。LPS(100μg/mL)組在 24h 到 72h 三個時間段內(nèi)每組細(xì)胞活力均呈下降趨勢。總體來看 24 小時為較適宜的炎癥反應(yīng)時間。
【學(xué)位授予單位】：蘭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R782.6

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本文編號：2640319