【摘要】：背景與目的：牙周病是指發(fā)生在牙齒支持組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)）的慢性、非特異性、感染性疾病。其最大的危害是導(dǎo)致罹患牙齒的松動脫落，從而引起發(fā)音、功能和面部形態(tài)變化。人牙周膜成纖維細(xì)胞（humanperiodontal ligament cell，hPDLC）是牙周組織的主要細(xì)胞，為力學(xué)敏感細(xì)胞，在牙周組織的修復(fù)改建中起很重要的作用�；罴�(xì)胞具有內(nèi)在的力學(xué)性質(zhì)，能夠響應(yīng)外界環(huán)境的變化，通過改變自身的力學(xué)性質(zhì)來調(diào)節(jié)相應(yīng)的生物過程中的狀態(tài)。細(xì)胞彈性模量是反映細(xì)胞生物力學(xué)性質(zhì)的重要參數(shù)，與細(xì)胞的移動、分化、凋亡有密切的聯(lián)系。內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）成分，是牙周病的重要病因之一。早期關(guān)于內(nèi)毒素對牙周膜成纖維細(xì)胞的影響，多集中于內(nèi)毒素刺激牙周膜成纖維細(xì)胞后細(xì)胞因子的變化，關(guān)于內(nèi)毒素對hPDLC的力學(xué)性質(zhì)是否產(chǎn)生影響，未見文獻(xiàn)報(bào)道。本課題采用原子力顯微鏡初步觀察牙周膜成纖維細(xì)胞經(jīng)LPS作用后的彈性模量變化，以期對LPS在牙周炎的致病機(jī)理有進(jìn)一步認(rèn)識。 方法：采用酶消化組織塊法獲取原代hPDLC，取第5-8代hPDLC用于實(shí)驗(yàn)；利用AFM接觸模式對hPDLC進(jìn)行掃描成像，獲取hPDLC的超微結(jié)構(gòu)圖像；實(shí)驗(yàn)分為正常培養(yǎng)組、0.1ug/ml LPS刺激組、1ug/ml LPS刺激組、10ug/ml LPS刺激組；各實(shí)驗(yàn)組正常培養(yǎng)后加入含相應(yīng)濃度LPS的細(xì)胞培養(yǎng)液刺激細(xì)胞24小時，采用10μm左右微球修飾的原子力顯微鏡探針，通過AFM獲取各組hPDLC細(xì)胞核相對應(yīng)區(qū)域的力曲線，借助赫茲模型計(jì)算細(xì)胞彈性模量，通過方差分析比較各組間的差異。 結(jié)果：對照組、0.1μg/ml的LPS刺激組、1μg/ml的LPS刺激組、10μg/ml的LPS刺激組hPDLC彈性模量依次為1.958±0.922KPa、1.448±0.999、2.477±1.656KPa、3.654±1.926KPa。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示,與對照組相比,0.1μg/ml的LPS刺激組細(xì)胞彈性模量明顯降低,1μg/ml的LPS刺激組細(xì)胞彈性模量無明顯差異,10μg/ml的LPS刺激組細(xì)胞彈性模量明顯升高。各實(shí)驗(yàn)組相比,隨著內(nèi)毒素濃度的增加,細(xì)胞彈性模量逐漸升高。 結(jié)論：hPDLC的彈性模量會因LPS的刺激而發(fā)生變化，提示LPS在牙周病致病機(jī)理方面可能存在新的機(jī)制。
【圖文】：

2.3.6 hPDLC 鑒定：將第四代 hPDLC 經(jīng) 0.25%胰蛋白酶消化后，將細(xì)胞以 2×10/ml接種于放有 2cm×2cm 大小的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，常規(guī)培養(yǎng)，待長滿蓋玻片單層后取出，用 37℃PBS 沖洗 2 遍去除表面培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞 20min，PBS 清洗 3 遍，采用常規(guī) sABC 法進(jìn)行波形絲蛋白、角蛋白染色，光鏡下觀察、照相記錄。3 結(jié)果hPDLC 以組織塊為中心呈放射狀排列生長，一般在 7 天左右從組織塊中長出，鏡下觀察細(xì)胞呈長梭形，胞體豐滿，胞漿均勻，核圓形或暖圓形，核仁清晰（圖 1a）。傳代后的細(xì)胞生長旺盛，狀態(tài)良好，性狀穩(wěn)定。細(xì)胞免疫組化鑒定結(jié)果：本組細(xì)胞角蛋白染色陰性（圖 1b），波形絲蛋白染色陽性（圖 1c）。表明該細(xì)胞不是上皮來源細(xì)胞，而是中胚層來源的細(xì)胞。

圖 2 接觸模式下 hPDLC 的 AFM 高分辨圖像(80×80μm)a)形貌像：hPDLC 的相對高度圖，標(biāo)尺表示亮度越大該點(diǎn)的高度越高 b)3D 圖像：hPDLC 形貌的三維圖像，顯示出真實(shí)空間的兩細(xì)胞三維形態(tài) c)偏轉(zhuǎn)像：能夠清晰的反映兩細(xì)胞邊緣部位，在邊緣部位更加鮮明表現(xiàn)應(yīng)力纖維的結(jié)構(gòu) d)摩擦力像：根據(jù)針尖與細(xì)胞膜接觸掃描過程中的摩擦力生成的圖像(圖像大小為 80×80μm)Fig 2 The high resolution imaging of hPDLC in contact mode of AFMa)Topographical image: topography of hPDLC. Brightness in the bar represents the relative elevation.b)3D image :The 3D image of hPDLC, showing the three-dimensional torphology of the cell in realspace c)Deflection image:it can clearly reflect the edge area of cell and the stress fiber structured)The friction image: the image generated according to the friction between the tip and cellmembrane in the process of scanning (image size is 80 *80μm)17
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.4

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本文編號：2626653