【摘要】： 齲病是一種最為常見的、嚴(yán)重危害人類口腔健康的口腔感染性疾病之一。變形鏈球菌( Streptococcus mutans, S. mutans)是人類齲病的主要致病菌,其致齲毒力因子主要表現(xiàn)在對牙面的粘附和利用碳水化合物產(chǎn)生多糖以及產(chǎn)酸、耐酸。含有GGDEF結(jié)構(gòu)域的蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型蛋白,其主要功能是參與單磷酸鳥苷環(huán)二聚體(bis-(3’-5’)-cyclic dimeric guanosine monophosphate, c-di-GMP)的合成。c-di-GMP已被證實是原核細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中一類新的第二信使,它的作用涉及生物膜的形成、毒力因子的表達、細(xì)胞間的通訊、激發(fā)免疫系統(tǒng)的應(yīng)答等多個方面,是細(xì)菌生存和代謝的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一,但其在變形鏈球菌中的研究尚屬空白。本研究主要是針對外源性c-di-GMP對變形鏈球菌致齲過程作用及其機制的初步研究,為防齲探索一條新的途徑。 第一部分:外源性c-di-GMP對變形鏈球菌致齲過程影響的初步研究 對生物膜影響的研究:在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上形成變形鏈球菌生物膜,不同濃度的外源性c-di-GMP作用于生物膜48 h,將生物膜進行染色,乙醇/丙酮混合液顯色,使用酶標(biāo)儀測定光密度值,觀測生物膜形成量的改變,等質(zhì)量的生理鹽水作為陰性對照。同時在離體牙的新鮮釉質(zhì)片上形成變形鏈球菌生物膜,200μM的c-di-GMP與等量的生理鹽水分別作用于生物膜48 h,掃描電鏡觀察結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果c-di-GMP處理組與生理鹽水組相比,生物膜形成能力明顯下降,細(xì)菌排列無明顯規(guī)律,細(xì)胞外基質(zhì)減少,提示200μM的c-di-GMP可有效抑制變形鏈球菌生物膜形成能力。 對產(chǎn)酸、耐酸影響的研究:外源性c-di-GMP與生理鹽水分別加入至含變形鏈球菌UA159菌液的不同pH的BHI培養(yǎng)基中,精密數(shù)顯酸度計測終末pH值,以pH的差值(△pH)表示產(chǎn)酸結(jié)果,比較兩組△pH,分析c-di-GMP對變形鏈球菌UA159產(chǎn)酸能力的影響;在pH=5的培養(yǎng)液中孵育2 h,以孵育前后細(xì)菌存活數(shù)量的比值評價細(xì)菌耐酸能力。結(jié)果: c-di-GMP處理組與生理鹽水組相比,產(chǎn)酸、耐酸能力明顯下降,提示c-di-GMP可以抑制變形鏈球菌的產(chǎn)酸、耐酸能力。 對胞外多糖形成能力影響的研究:將變形鏈球菌UA159厭氧培養(yǎng),外源性c-di-GMP與生理鹽水分別加入至變形鏈球菌培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h,用等同培養(yǎng)基體積的蒸餾水洗2次,將3次上清液合并作為水溶性胞外多糖,水洗后的菌胞中加入等體積0.5 mol/L NaOH洗3次,合并上清液,作為水不溶性胞外多糖。上述兩部分上清液各取1.5ml,加入3倍體積無水乙醇,4℃過夜,離心后棄水相,將沉淀分別在等體積的蒸餾水及0.1mol/L NaOH中溶解,用蒽酮法分別測定水溶性及水不溶性葡聚糖的含量,在OD620比色,以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算UA159合成的水溶性及水不溶性葡聚糖的含量,對兩組進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干預(yù)組生成水不溶性糖的量明顯減少。提示外源性c-di-GMP對變形鏈球菌合成胞外多糖的能力有一定的影響。 對唾液包被的HA表面黏附的影響:選取熒光標(biāo)記物BCECF/AM標(biāo)記變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株UA159,用唾液包被的羥基磷灰石(SHA)模擬口腔中的牙面情況,外源性c-di-GMP與生理鹽水分別與熒光標(biāo)記的UA159菌液,SHA共同孵育30分鐘,于熒光酶標(biāo)儀上以激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長535 nm測定各孔,扣除陰性對照的結(jié)果作為測定的熒光值。按照公式計算黏附率,比較兩組的區(qū)別。結(jié)果: c-di-GMP處理組與生理鹽水組相比,粘附能力明顯下降。綜述上述各結(jié)果,提示外源性c-di-GMP對變形鏈球菌的致齲特性均有一定程度的抑制能力,因此可以單獨也可以與其它的抗齲制劑聯(lián)合應(yīng)用控制齲病,有望成為一種新型防齲方法。 第二部分:外源性c-di-GMP防齲的動物實驗研究 選用20 d齡的SD大鼠感染致齲菌,并飼以致齲飼料2000 #誘齲成功后,分別用適量外源性c-di-GMP、氟化鈉水溶液、0.9%的氯化鈉給大鼠施藥,用唾液取樣細(xì)菌培養(yǎng)記錄大鼠口腔內(nèi)變形鏈球菌數(shù)量、齲齒記分觀察外源性c-di-GMP在動物口內(nèi)對致齲菌的生長繁殖以及對齲病發(fā)生、發(fā)展的影響,并以氟化鈉為陽性對照。結(jié)果:實驗中大鼠食物、水消耗,各組間未見明顯差異,保證了各組大鼠所受致齲攻擊性相同。藥物處理期間,大鼠口腔黏膜未見紅斑、腫脹等異常表現(xiàn)。提示外源性c-di-GMP沒有明顯毒性,同時,發(fā)現(xiàn)外源性c-di-GMP處理組大鼠咬合面齲及光滑面齲齒計分顯著低于陰性對照組,但是大鼠口腔內(nèi)變形鏈球菌定植數(shù)量未見明顯差異,提示了c-di-GMP作為未來新型防齲途徑的可行性。 第三部分:變形鏈球菌gcp基因失活菌株的構(gòu)建、鑒定及致齲特性研究 以前期研究中pMD19T-gcp為模板, PCR擴增873bp的gcp基因內(nèi)部序列,連接T載體后將該內(nèi)部片段定向插入自殺載體pVA8912,酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)PCR產(chǎn)物及插入片段大小與預(yù)期值相符,表明成功構(gòu)建了打靶載體pVA8912/gcp;將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化變形鏈球菌UA159株,挑取陽性克隆,提取基因組DNA,用PCR結(jié)合酶切鑒定發(fā)現(xiàn)gcp基因失活株基因組中g(shù)cp基因內(nèi)部成功插入了打靶載體片段。結(jié)果表明成功構(gòu)建了變形鏈球菌gcp基因失活株,為該基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。 厭氧培養(yǎng)變形鏈球菌gcp基因失活株,在不同時間點測定OD600值,繪制生長曲線,發(fā)現(xiàn)gcp基因失活株和野生菌的生長曲線無顯著性差異,表明gcp的基因失活對變形鏈球菌的生長無顯著影響。 將gcp失活菌和野生菌菌懸液轉(zhuǎn)入無菌的96孔酶標(biāo)板中厭氧培養(yǎng)48h,黏附菌使用結(jié)晶紫溶液染色,乙醇/丙酮混合液顯色,測量OD575值,以定量反映生物膜形成量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)gcp失活菌生物膜形成量顯著低于野生菌,表明gcp可能與變形鏈球菌生物膜形成能力有關(guān)。 熒光標(biāo)記gcp失活菌和野生菌,與唾液包被的羥基磷灰石粉末共同孵育后,測定羥基磷灰石沉淀的熒光值,比較粘附率的差異,發(fā)現(xiàn)gcp失活菌的黏附率(45.33%±6.35%)低于野生菌(64.05%±6.73%),差異有顯著性(P 0.05);說明gcp可能對變形鏈球菌與唾液包被的羥基磷灰石的黏附有關(guān),對這種黏附有一定的抑制作用。 總之,本研究證明變形鏈球菌內(nèi)部存在c-di-GMP信號通路,該通路介導(dǎo)變形鏈球菌的生物膜形成及在離體牙釉質(zhì)表面的黏附,外源性c-di-GMP具有降低變形鏈球菌生物膜的形成,產(chǎn)酸、耐酸、體外黏附等特性。上述結(jié)果為揭示變形鏈球菌黏附致齲的分子機理以及建立新的防齲途徑提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

2.1 c-di-GMP 對UA159黏附率的影響在熒光顯微鏡下我們可以清楚的看到熒光標(biāo)記物BCECF/AM被成功吸附至變形鏈球菌（圖1.4.1），說明標(biāo)記的菌液黏附至SHA。同時統(tǒng)計結(jié)果表明200 μM c-di-GMP 明顯抑制了變形鏈球菌的黏附能力（圖1.4.2），與對照組相比其黏附能力下降了50%（P<0.05）。圖 1.4.1 熒光標(biāo)記的變形鏈球菌 UA159 對唾液包被羥基磷灰石的黏附（綠色為熒光標(biāo)記的細(xì)菌，棕色為羥基磷灰石顆粒，A：普通光鏡圖像；B：同一視野的熒光顯微鏡圖像；C：A、B 重合照片 ）52

實驗開始時, 各組間大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義; 實驗期間, 大鼠體質(zhì)量均勻增加; 實驗結(jié)束各組間大鼠體質(zhì)量增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3.2 大鼠口腔變形鏈球菌計數(shù)結(jié)果見圖2.1圖 2.1 大鼠口腔感染變形鏈球菌，各實驗組處理 89 d 時變形鏈球菌計數(shù)結(jié)果唾液變形鏈球菌計數(shù)(圖2.1)，經(jīng)統(tǒng)計分析，3 組間變形鏈球菌計數(shù)結(jié)果相差顯著( P < 0. 05) ，，兩兩比較氟化鈉組和氯化鈉組和外源性c-di-GMP組相差顯著( P < 0. 05) ，而外源性c-di-GMP組同陰性對照組相比相差不大。59
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R78

【引證文獻】

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2 黃曼;蔡欣;玉佳男;唐翠娥;劉睿;;高粱原花青素四聚體干預(yù)Streptococcus mutans Ingbritt(c)體外黏附途徑及機理[J];食品科學(xué);2014年03期

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1 黃曼;原花青素四聚體干預(yù)變形鏈球菌血清型c體外粘附途徑及機理研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2013年

本文編號：2626236