發(fā)布時間：2020-04-12 19:44

【摘要】：目的探討巴西蘇木素對人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞增殖、凋亡和自噬的影響及其分子機制,為臨床用藥提供理論依據(jù)。方法用MTT法檢測巴西蘇木素對Tca8113細(xì)胞的增殖作用;Hoechst33342染色法觀察細(xì)胞形態(tài)變化;Annexin V/PI雙染色檢測巴西蘇木素對Tca8113細(xì)胞凋亡程度的影響;Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白bax、bcl-2、cleaved caspase3及自噬相關(guān)蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B、p62的表達(dá);使用AMPK通路抑制劑與巴西蘇木素共同作用于Tca8113細(xì)胞,并檢測通路相關(guān)蛋白p-AMPK、p-mTOR、LC3B的表達(dá)。結(jié)果 MTT結(jié)果表明,巴西蘇木素能明顯抑制Tca8113細(xì)胞的增殖,24 h時IC50為31.17μmol/L;Hoechst33342染色結(jié)果顯示,巴西蘇木素能使Tca8113細(xì)胞發(fā)生凋亡形態(tài)學(xué)改變,且與濃度正相關(guān);Annexin V/PI染色結(jié)果顯示,不同濃度巴西蘇木素作用24 h后,細(xì)胞凋亡數(shù)和凋亡率均高于空白對照組;Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果表明,巴西蘇木素可抑制抗凋亡蛋白bcl-2,促進(jìn)凋亡關(guān)鍵蛋白bax和cleaved-caspase3的表達(dá),同時增加LC3B和p-AMPK的表達(dá),降低p62和p-mTOR表達(dá)。在與抑制劑合用后,p-AMPK與LC3B表達(dá)量雖仍略高于空白對照組,但與單純使用巴西蘇木素相比均明顯降低,而p-mTOR的表達(dá)較巴西蘇木素組則明顯升高(P0.05)。結(jié)論巴西蘇木素能抑制Tca8113細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡,同時可通過AMPK/mTOR通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。
【圖文】：

蘇木素濃度為40μmol/L，CompoundC為5μmol/L。給藥時，巴西蘇木素和AMPK抑制劑組中兩種藥物同時給作用于Tca8113細(xì)胞。收集各組給藥后24h細(xì)胞樣品，用于Westernblot檢測蛋白p-AMPK及p-mTOR表達(dá)。1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)皆采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行不同組之間比較，SNK法兩兩比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1巴西蘇木素抑制Tca8113細(xì)胞增殖MTT結(jié)果顯示，經(jīng)巴西蘇木素處理后，Tca8113細(xì)胞增殖明顯被抑制，且該抑制作用隨藥物濃度的增大而增強（圖1，P<0.05）。巴西蘇木素作用于Tca8113細(xì)胞24h時，半數(shù)抑制濃度（IC50）為31.17μmol/L。2.2巴西蘇木素促進(jìn)Tca8113細(xì)胞凋亡使用Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下觀察到，空白對照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，胞核完整，染色均勻，經(jīng)不同*********100806040200Inhibitonrate(%)0151020304080100200Brazilin(μmol/L)圖1巴西蘇木素對Tca8113細(xì)胞增殖的影響Fig.1InhibitoryeffectofbrazilinatdifferentconcentrationsonproliferationofTca8113cells.*P<0.05vs0μmol/L.··352JSouthMedUniv,2019,39(3):351-356http://www.j-smu.com

濃度藥物作用24h后，細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞核發(fā)生不同程度改變。細(xì)胞扁圓，核膜消失，染色質(zhì)皺縮，胞核碎裂，部分胞核呈“新月狀”和“花瓣狀”，且該形態(tài)變化隨藥物濃度增加而更加明顯（圖2）。50μm50μm50μm50μmBrazilin(μmol/L)0203040圖2巴西蘇木素對Tca8113細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響Fig.2EffectofbrazilinonthemorphologyofTca8113cells(Originalmagnification:×200).通過流式細(xì)胞儀檢測各組凋亡情況，結(jié)果顯示：不同濃度巴西蘇木素作用于Tca8113細(xì)胞24h后，細(xì)胞凋亡率隨藥物濃度增加而增加（圖3），濃度為20、30、40μmol/L時，Tca8113細(xì)胞存活率分別為8.48%、10.26%、25.54%，均高出空白對照組7.06%。除20μmol/L外，，另外兩組與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。2.3巴西蘇木素通過激活線粒體途徑誘導(dǎo)Tca8113細(xì)胞凋亡Westernblot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，不同濃度的巴西蘇木素作用24h后，凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)量明顯升高（P<0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)量顯著降低（P<0.05）；同時，各實驗組凋亡關(guān)鍵蛋白cleavedcaspase3的表達(dá)水平均明顯高于空白對照組的表達(dá)水平（P<0.05，圖3）。3討論巴西蘇木素作為中藥蘇木的主要活性成分之一，其抗腫瘤作用已被廣泛研究和報道，包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［4］、膀胱癌［6］、頭頸鱗狀細(xì)胞癌［7］等。研究發(fā)現(xiàn)，巴西蘇木素能抑制舌癌細(xì)胞Tca8113細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］，但巴西蘇木素對舌癌細(xì)胞的抑制作用的具體機制尚不清楚。本實驗采用MTT細(xì)胞活力檢測法觀察巴西蘇木素0203040Brazilin(μmol/L)***0203040302520151050Apoptosisrate(%)AnnexinV-FITCPIBrazilin(μmol/L)0203040圖3巴西蘇?

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本文編號：2625109