【摘要】： 絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松發(fā)展迅速,與機(jī)體雌激素缺乏有關(guān)。研究表明雌激素在骨吸收與改建中發(fā)揮了極其重要的作用,雌激素缺乏可以引起全身骨質(zhì)疏松。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)[1],動(dòng)物的年齡增長可導(dǎo)致骨髓基質(zhì)細(xì)胞中骨祖細(xì)胞數(shù)量減少,這是骨質(zhì)疏松癥的重要原因之一,但絕經(jīng)后女性骨量減少同時(shí)常伴有骨髓中脂肪組織增多的分子機(jī)制尚未明了[2]。也有實(shí)驗(yàn)證明[3]。體外培養(yǎng)的BMSCs在一定濃度雌激素的作用下,增殖能力增強(qiáng),成骨能力增強(qiáng),成脂能力減弱。但體外培養(yǎng)BMSCs和體內(nèi)生長的BMSCs情況不同。是否去勢(shì)后大鼠BMSCs的自身特性已發(fā)生改變,這有待證實(shí)。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行分離培養(yǎng),利用BMSCs的多向分化培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀分析對(duì)去勢(shì)大鼠BMSCs進(jìn)行鑒定,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況,MTT法測(cè)量兩組BMSCs增殖能力鑒定,同時(shí)用PCR的方法檢測(cè)去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨、成脂基因,進(jìn)而研究去勢(shì)后大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞增殖特性、成骨成脂能力的變化。為研究骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制奠定基礎(chǔ),進(jìn)一步探討正畸過程中骨組織改建的機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)分三部分: 1、大鼠骨質(zhì)疏松模型的建立 目的:用大鼠建立骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型。方法:3月齡雌性SD大鼠12只,體重約300g。按體重隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(去勢(shì)組)和對(duì)照組(假手術(shù)組),1 %戊巴比妥鈉(30 mg/ kg)行腹腔內(nèi)注射麻醉,用雙能X線骨密度儀及所附的小動(dòng)物骨密度測(cè)試軟件測(cè)量其整體股骨骨礦物質(zhì)密度(bone mineraldensity,BMD),在無菌條件下實(shí)驗(yàn)組經(jīng)雙側(cè)腰背部切口切除雙側(cè)卵巢,對(duì)照組以相同切口切除卵巢周圍少量脂肪組織。3月后測(cè)量大鼠體重,并頸椎脫臼法處死,無菌操作下完整取出兩組大鼠雙側(cè)后肢股骨,剔盡周圍軟組織后一側(cè)股骨按上述方法再次測(cè)量其整體股骨BMD,另一側(cè)留作細(xì)胞培養(yǎng)。結(jié)果:所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均順利通過實(shí)驗(yàn)全過程,去勢(shì)組大鼠體重、雌二醇及整體股骨骨礦物質(zhì)密度(BMD)與假手術(shù)組比較差異有顯著性( P 0. 01 )。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)成功建立了大鼠骨質(zhì)疏松模型。 2、去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)鑒定及增殖特性的變化 目的:對(duì)去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行分離培養(yǎng)鑒定,研究去勢(shì)后大鼠BMSCs增殖特性的變化。方法:密度梯度離心分離骨質(zhì)疏松大鼠的BMSCs,利用BMSCs的多向分化培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀分析對(duì)去勢(shì)大鼠BMSCs進(jìn)行鑒定,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞增殖情況,MTT法測(cè)量兩組BMSCs增殖能力。結(jié)果:誘導(dǎo)培養(yǎng)后兩組大鼠BMSCs油紅O染色和Von Kossa′s染色實(shí)驗(yàn)陽性,流式細(xì)胞儀顯示骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有的表面抗原CD29和CD44陽性而造血干細(xì)胞具有的表面抗原CD45和CD133為陰性。MTT法測(cè)定在7天內(nèi),去勢(shì)組細(xì)胞的增殖速率要高于假手術(shù)組。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)分離的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞具有成骨能力和成脂能力,從而證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)分離的細(xì)胞為具有多向分化潛能的BMSCs。去勢(shì)后三個(gè)月大鼠BMSCs增殖能力增強(qiáng)。 3、去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞其成骨成脂能力的研究 目的:通過檢測(cè)去勢(shì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨成脂基因的變化,研究其成骨成脂能力的變化。方法:通過RT-PCR的方法檢測(cè)兩組大鼠(去勢(shì)組,假手術(shù)組)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞mRNA水平變化,成骨比較采用ALP(堿性磷酸酶)、BSP(骨唾液蛋白)、成脂比較采用PPARγ2(過氧化物酶體增殖物激活受體γ2)。結(jié)果:成骨誘導(dǎo)15d的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞BSP和ALP基因的表達(dá)量較低,成脂誘導(dǎo)15d的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞PPARγ2基因的表達(dá)量較高。結(jié)論:去勢(shì)大鼠的成骨能力減弱,成脂能力增強(qiáng)。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文在不同時(shí)間點(diǎn)加入 5%MTT 20μl，4h 后再加入 150μl DMSO，振蕩后酶聯(lián)檢測(cè)儀(490nm 波長)測(cè)光吸收值(OD 值)，以反映其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用 SPSS10.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，，兩組間差異比較采用 t 檢驗(yàn)。2 結(jié)果2.1 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠 BMSCs 的形態(tài)學(xué)觀察倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分裂增殖的速率要高于對(duì)照組，取兩組大鼠的第三代 BMSCs，12h 后開始有梭形或紡錘形細(xì)胞貼壁（圖 4）；2d 后圓形細(xì)胞進(jìn)一步減少，而梭形細(xì)胞集落增多（圖 5）；3d 后逐漸成三角形或多邊形生長，細(xì)胞體積變大，胞漿豐富，達(dá) 80%以上融合（圖 6）。同一時(shí)間、同一光鏡視野下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁細(xì)胞數(shù)目要大于對(duì)照組。

倒置顯微鏡觀察實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分裂增殖的速率要高于對(duì)照組，取兩組大鼠的第三代 BMSCs，12h 后開始有梭形或紡錘形細(xì)胞貼壁（圖 4）；2d 后圓形細(xì)胞進(jìn)一步減少，而梭形細(xì)胞集落增多（圖 5）；3d 后逐漸成三角形或多邊形生長，細(xì)胞體積變大，胞漿豐富，達(dá) 80%以上融合（圖 6）。同一時(shí)間、同一光鏡視野下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁細(xì)胞數(shù)目要大于對(duì)照組。圖 4 倒置顯微鏡觀測(cè)大鼠 BMSCs 原代培養(yǎng) 12h 的形態(tài)（×100）
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R78;R580

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本文編號(hào)：2624311