【摘要】：目的:牙周炎是心血管疾病的獨立危險因素,牙周感染會增加血管鈣化的風(fēng)險。牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Pg-LPS)可促進大鼠主動脈平滑肌細胞(VSMCs)的異常增殖和堿性磷酸酶(ALP)活性,對相關(guān)鈣化基因ALP、核心結(jié)合因子αl(Cbfαl)、骨涎蛋白(BSP)和骨橋蛋白(OPN)均具有促表達作用。但體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜,Pg-LPS在體內(nèi)情況下對VSMCs的作用尚待研究。利用Transwell小室建立的兩種細胞的共培養(yǎng)模型可以更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境,本實驗利用Transwell小室建立體外人牙周膜細胞(HPDLCs)和人臍動脈平滑肌細胞(HUASMCs)共培養(yǎng)系統(tǒng),初步探究Pg-LPS刺激時,對HPDLCs共培養(yǎng)條件下的HUASMCs增殖和ALP活性以及對其相關(guān)鈣化基因mRNA(ALP、Cbfαl、BSP)表達的影響。方法:1.細胞培養(yǎng):采用I型膠原酶+組織塊法獲得原代HPDLCs,HUASMCs原代購自美國ScienceCell公司,傳代培養(yǎng)并鑒定HPDLCs和HUASMCs;利用Transwell小室建立HPDLCs-HUASMCs體外共培養(yǎng)系統(tǒng)。2.CCK-8法檢測HUASMCs增殖:實驗分4組以及各組處理情況:C組(單獨正常培養(yǎng) HUASMCs);C-P 組(HUASMCs+Pg-LPS);CO 組(HPDLCs-HUASMCs共培養(yǎng))和CO-P組(HPDLCs-HUASMCs共培養(yǎng)+Pg-LPS)。實驗所加Pg-LPS的濃度均為lμg/ml。各組細胞均培養(yǎng)48h后,采用CCK-8法和堿性磷酸酶試劑盒分別測定各組中HUASMCs的增殖和其ALP的活性。3.鈣化誘導(dǎo)茜素紅S染色及鈣化結(jié)節(jié)定量分析:采用Pg-LPS和含維生素C、地塞米松、β-甘油磷酸鈉的鈣化誘導(dǎo)液誘導(dǎo)HUASMCs成骨分化。實驗分8組以及各組處理情況:C組(單獨正常培養(yǎng)HUASMCs);C-P組(單獨培養(yǎng)HUASMCs+Pg-LPS);C-C組(單獨培養(yǎng)HUASMCs鈣化誘導(dǎo));C-CP組(單獨培養(yǎng)HUASMCs鈣化誘導(dǎo) + Pg-LPS);CO 組(HPDLCs-HUASMCs 共培養(yǎng))；CO-P 組(HPDLCs-HUASMCs 共培養(yǎng)+Pg-LPS);CO-C 組(HUASMCs-PDLCs 共培養(yǎng)鈣化誘導(dǎo))和 CO-CP組(HUASMCs-PDLCs共培養(yǎng)鈣化誘導(dǎo)+Pg-LPS)。作用21 d后使用茜素紅S染鈣化結(jié)節(jié),并定量檢測鈣化結(jié)節(jié)。4.RealTimePCR檢測鈣化相關(guān)因子(ALP、Cbfαl、BSP等)的表達:實驗分組及各組處理情況同方法3,培養(yǎng)48h后,采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)分別檢測Pg-LPS對各組HUASMCs中成骨分化相關(guān)基因ALP、Cbfαl和BSPmRNA表達的影響。結(jié)果:1.細胞培養(yǎng):采用Ⅰ型膠原酶+組織塊法成功培養(yǎng)出HPDLCs,并成功建立HPDLCs-HUASMCs共培養(yǎng)系統(tǒng)。2.HUASMCs的增殖:C-P組和CO-P組中HUASMCs的增殖和ALP活性分別強于C組和CO組;且共培養(yǎng)的CO-P組中HUASMCs的增殖和ALP活性強于單獨培養(yǎng)的C-P組。3.茜素紅S染色和結(jié)節(jié)定量結(jié)果表明:鈣化誘導(dǎo)各組較普通培養(yǎng)各組鈣化結(jié)節(jié)明顯增多;且在不同培養(yǎng)條件下,Pg-LPS均促進鈣化結(jié)節(jié)的形成;而共培養(yǎng)的CO-C組和CO-CP組鈣化能力分別強于單獨培養(yǎng)的C-C組和C-CP組。4.RT-PCR結(jié)果示:Cbfαl、ALP、BSP在鈣化誘導(dǎo)組的表達分別明顯高于普通培養(yǎng)組的;在含Pg-LPS的各組的表達顯著高于不含Pg-LPS的各組;Pg-LPS或鈣化誘導(dǎo)液以及兩者同時存在的時候,共培養(yǎng)各組的鈣化能力分別高于單獨培養(yǎng)的各組。結(jié)論:Pg-LPS可能通過促進HUASMCs增殖增強、ALP活性和上調(diào)鈣化相關(guān)基因(ALP、Cbfαl、BSP)的表達進而影響其鈣化;且與HPDLCs共培養(yǎng)條件下對HUASMCs的鈣化作用更強;提示牙周炎可能比單純的炎癥更能促進血管鈣化的發(fā)生發(fā)展,牙周炎對心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有一定的促進作用。
【圖文】：

１邋ＨＰＤＬＣｓ的原代及傳代培養(yǎng)逡逑用組織塊＋酶消化法揞養(yǎng)ＨＰＤＬＣｓ，約３－５夭可見有細胞從組織塊邊緣游出，細逡逑胞數(shù)量逐漸X椂嘀磷櫓櫓芪Ы洗蟮納ぴ位蛄映善笨山寫ㄍ跡玻保粒楨義瞎庋暈⒕迪鹿鄄歟杉赴食に笮位蛐切�，放射状排列，核詺埼幌u衷殘�，胞辶x現(xiàn)史崧�、均札x氏殖齔上宋赴男翁ㄍ跡玻�，n╁義希礤義賢跡玻卞澹齲校模蹋茫蟮腦按嘌埃矗埃義希ǎ粒號嘌誹旌螅澹齲校模蹋茫蟠幼櫓楸咴滌緯觶唬攏捍嘌冢炒模齲校模蹋茫蟪食に笮五義匣蛐切危派渥磁帕校╁義希保插義，

本文編號：2617565