發(fā)布時(shí)間：2020-04-06 08:29

【摘要】：[目的]探討轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號(hào)通路抑制劑SB431542,在體內(nèi)外對(duì)人牙齦間充質(zhì)干細(xì)胞(human gingival mesenchymal stem cells,hGMSCs)骨向分化的影響;并對(duì)該抑制劑在hGMSCs成骨過程中的作用機(jī)制進(jìn)行初步探討,為基于自體干細(xì)胞的骨缺損再生修復(fù)治療提供新的細(xì)胞來源。[方法]組織塊法分離培養(yǎng)hGMSCs,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測表面標(biāo)志物、克隆集落形成實(shí)驗(yàn)及體外成骨誘導(dǎo)分化對(duì)hGMSCs進(jìn)行鑒定;給予hGMSCs不同濃度(0、0.1、1和10μmol/L)SB435142處理,CCK-8及流式細(xì)胞儀分別檢測增殖活性及凋亡比例;SB435142成骨誘導(dǎo)21d后,進(jìn)行茜素紅染色,比較礦化結(jié)節(jié)形成的能力,并用Western blot檢測成骨相關(guān)蛋白R(shí)unt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)、堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原蛋白(COL-1)及骨橋蛋白(OPN)的表達(dá);體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為三組:Bio-Oss(?)組,Bio-Oss(?)/hGMSCs組及Bio-Oss(?)/hGMSCs/SB431542組,分別移植于裸鼠背部皮下,12周后取出移植物,固定脫鈣后進(jìn)行切片,HE及Masson染色,比較成骨效果;采用Western blot或者qRT-PCR檢測SB431542誘導(dǎo)hGMSCs成骨過程中TGF-β及骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)信號(hào)通路的變化并做驗(yàn)證。[結(jié)果]1.成功分離培養(yǎng)出hGMSCs,細(xì)胞高表達(dá)MSCs表面標(biāo)志物CD44(100%±0.00%),CD73(99.99%±0.01%),CD90(100%±0.00%)和CD105(99.93%±0.03%),陰性表達(dá)造血干細(xì)胞及白細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34(0.02%±0.01%),CD45(0.00%±20.01%),CD19(0.03%±0.02%),CD11b(0.03%±0.02%),HLA-DR(0.03%±0.023%)和HLA-DQ(0.06±0.03%),且具有自我更新及成骨分化能力。2.與對(duì)照組相比,各處理濃度SB431542未引起hGMSCs凋亡率的明顯改變(p0.05),而10 μmol/L SB431542作用于hGMSCs第7天時(shí),細(xì)胞增殖能力較對(duì)照組降低(p0.05);3.1 μnol/L SB431542能顯著增加hGMSCs礦化結(jié)節(jié)的形成(p0.05),且成骨相關(guān)蛋白R(shí)UNX2、ALP、COL-1及OPN的表達(dá)均明顯高于對(duì)照組及空白組(p0.05);4.裸鼠皮下移植 12周后,HE及Masson染色結(jié)果顯示,Bio-Oss(?)/hGMSCs/SB431542 組新生骨量明顯多于 Bio-Oss(?)/hGMSCs 組及Bio-Oss(?)組(p0.05);5.在hGMSCs成骨過程中,SB431542處理組的TGF-β信號(hào)通路下游信號(hào)分子SMAD3磷酸化水平明顯被抑制(p0.05),相反,BMP2及BMP4表達(dá)較對(duì)照組明顯增高(p0.05),且BMP信號(hào)的抑制劑Noggin降低了SB431542誘導(dǎo)礦化結(jié)節(jié)的形成(p0.05)。[結(jié)論]1.TGF-β信號(hào)通路抑制劑SB431542可顯著增加hGMSCs在體內(nèi)外骨向分化潛能;2.SB431542提高h(yuǎn)GMSCs的成骨分化能力,可能是通過抑制TGF-β信號(hào)通路下游分子SMAD3磷酸化水平,激活BMP信號(hào),上調(diào)BMP2及BMP4,調(diào)控成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。
【圖文】：

逡逑■■逡逑圖２－ｌｈＧＭＳＣｓ分離培養(yǎng)不同時(shí)間的細(xì)胞形態(tài)（＞＜４０）邋（Ａ．原代培養(yǎng)０天；Ｂ．原代培養(yǎng)５天；逡逑Ｃ．原代培養(yǎng)１０天；Ｄ．第二代細(xì)胞）逡逑２．３．２邐ｈＧＭＳＣｓ克隆集落形成能力檢測逡逑經(jīng)過１４天培養(yǎng)，甲苯胺藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)ｈＧＭＳＣｓ形成一定數(shù)量的克隆，提示逡逑ｈＧＭＳＣｓ具有自我更新能力（圖２－２）。逡逑圖２－２邋ｈＧＭＳＣｓ克隆集落（Ａ．肉眼觀：Ｂ．鏡下觀ｘ４０）逡逑２．３．３邐ｈＧＭＳＣｓ表面標(biāo)志物流式鑒定逡逑流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果顯示，ｈＧＭＳＣｓ強(qiáng)陽性表達(dá)ＭＳＣｓ表面標(biāo)志物逡逑ＣＤ４４（１００％±０．００％），ＣＤ７３（９９．９９％±０．０１％），ＣＤ９０（１００％±０．００％）和邋ＣＤ１０５邋（９９．９３％逡逑±０．０３％邋）。不表達(dá)造血干細(xì)胞及巨噬細(xì)胞、Ｂ細(xì)胞表面標(biāo)志物ＣＤ３４逡逑（０．０２邋％±０．０１％），邋ＣＤ４５邋（０．００％±邋０．０１％），邋ＣＤ邋１９邋（０．０３％邋±０．０２％），邋ＣＤｌｌｂ逡逑（０．０３％±０．０２％），ＨＬＡ－ＤＲ（０．０３％±０．０２３％）和邋ＨＬＡ－ＤＱ（０．０６±０．０３％）（圖邋２－３，逡逑圖邋２－４）。逡逑ｉ［￣邋０．０４％邐｜｜邐０．０１邋％邋＇邋ｉＨ￣０．０４％邐Ｓ邐ｕｊｐ％邋Ｉ邐｜｜邐0％￣逡逑Ｐ邋＾邋．邋：邋ＩＩ邋，邐，邋Ｐ邋．邋Ｉ；邋Ｉ邋ｉｆ邋，逡逑■」邐ｉＪ邋ｉｌ邐ｓ邐Ｊｌ邐ｉ」逡逑■Ｗ２邋0ＣｄＳ邋ＦＴｒＩ？－Ａ邋１（１邐１４５0ＣＤｌ１°ｂＦｆＴＣ－Ａ，０邐�！�、９１。％丨１＾、〗。邐＾４１？邋°邋ＣＤ４５邋ＦＩＴＣ－Ａ，0逡逑９逡逑

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【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2616270