【摘要】：牙髓細胞是來源于神經嵴和間充質的多潛能細胞,主要由成牙本質細胞,成纖維細胞及未分化的間葉細胞組成,牙髓細胞是牙本質形成的關鍵。成牙本質細胞的增殖分化是牙胚發(fā)育和牙髓組織自我修復的關鍵。這一過程受多種基因和信號分子的調控。Dlx3為Dlx家族成員,位于17q21.33,在脊椎動物體內廣泛表達,參與表皮及外胚層附屬器官如腺體、牙齒、毛囊的發(fā)育。在牙齒發(fā)育過程中,Dlx3首先表達于牙源性上皮,在此成釉細胞分化為牙釉質,之后表達于牙源性上皮和間充質。之前的一些研究表明Dlx3參與成骨細胞的增殖分化,在軟骨內骨化過程中,Dlx3在干骺端端的軟骨區(qū)、分化中的成骨細胞、分化完成的成骨細胞中表達升高。在成骨細胞內高表達Dlx3,可以顯著上調成骨細胞分化的標記物。 成骨細胞和成牙本質細胞都來源于間充質細胞,具有相似的生物學行為,因此,我們推測Dlx3可能會在牙齒發(fā)育過程中影響牙髓細胞的增殖和分化。 本課題研究的目的是觀察Dlx3在調控牙髓細胞增殖及其向成牙本質細胞方向分化中的作用,探討Dlx3在人牙髓細胞增殖的作用機制。本研究包含兩個部分： 第一部分：DI×3在人牙髓細胞增殖及其向成牙本質分化中的作用 1DI×3在人牙髓細胞向成牙本質細胞分化過程中的表達 從新鮮拔除的正畸前磨牙獲取人牙髓細胞,礦化誘導液培養(yǎng)。Real-time、 Western blot檢測礦化過程中轉錄因子Dlx3及礦化相關因子DSPP的表達情況。結果：在礦化誘導液的作用下,細胞內Dlx3表達量逐漸升高,Dlx3表達趨勢與DSPP表達趨勢一致。結論：Dlx3在牙髓細胞的表達隨著分化程度而上升。 2DI×3穩(wěn)定感染細胞建立 通過PCR擴增質粒獲得Dlx3基因及啟動子CMV,用HpaI、XhoI雙酶切后將目的片段CMV+Dlx3連接到慢病毒載體pLL3.7質粒上,構建慢病毒表達質粒h-Dlx3-pLL3.7。h-Dlx3-pLL3.7或pLL3.7與psPAX2, pMD2.G起共同轉染293FT獲得病毒液,感染人牙髓細胞,得到穩(wěn)定高表達Dlx3或pLL3.7的細胞hDPC/Dlx3、 hDPC/pLL3.7。hDPC/Dlx3可同時表達GFP和Dlx3。熒光顯微鏡和流式細胞儀觀察感染效率,Real-time、Western blot檢測hDPC/Dlx3組Dlx3表達情況。結果：熒光顯微鏡下觀察GFP在0-14天都有較高的表達,流式細胞儀結果顯示超過90%的細胞表達GFP. hDPC/Dlx3組Dlx3mRNA和蛋白的表達都較對照組hDPC/wt及hDPC/PLL3.7顯著性升高。結論：成功構建了穩(wěn)定表達Dlx3的細胞群。 3DI×3對牙髓細胞增殖活性的影響 迎過直接細胞計數和EdU檢測Dlx3對人牙髓細胞增殖能力的影響。結果：直接細胞計數表明Dlx3感染的牙髓細胞增殖能力下降,而hDPC/wt、hDPC/pLL3.7兩組增殖能力相似。EdU檢測同樣顯示hDPC/Dlx3組EdU陽性細胞較對照組hDPC/wt、hDPC/pLL3.7,對照兩紐EdU陽性細胞率無統(tǒng)計學差異。結論：Dlx3抑制牙髓細胞的增殖。 4Dlx3對牙髓細胞分化的影響 為了研究Dlx3在牙髓細胞向成牙本質細胞分化過程中的作用,我們檢測了礦化結節(jié)形成,堿性磷酸酶活性,礦化相關基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin及牙本質特異性蛋白DSP、DMP1的表達。結果：體外連續(xù)礦化誘導培養(yǎng)28天,Von Kossa染色后相差顯微鏡下觀察礦化結節(jié)的形成發(fā)現hDPC/Dlx3組礦化結節(jié)數量和面積均大于hDPCs/pLL3.7、hDPCs/wt。堿性磷酸酶的活性也較對照組有顯著升高。Real-time結果顯示,礦化相關基因DSPP、DMP1、ALP、Nestin在第14天在hDPC/Dlx3組的表達均高于對照組,其中ALP表達提高最顯著,較對照組高15倍,DSPP、DMP1、Nestin較對照組高1.9-3倍。DSP、DMP1蛋白在hDPC/Dlx3組的表達均高于對照組,與DSPP、DMP1mRNA表達一致。結論：Dlx3通過上調礦化相關基因促進牙髓細胞向成牙本質方向分化。 第二部分：DIx3抑制牙髓細胞增殖的分子機制研究 1DKK抑制牙髓細胞增殖由DKK1介導 免疫熒光確定DKK1、Dlx3在人牙髓細胞中的表達,Real-time檢測Dlx3高表達對DKK1mRNA的影響,使用DKK1siRNA抑制內源性DKK1表達后,觀察是否可減弱Dlx3對牙髓細胞增殖的抑制作用。結果：Dlx3、DKK1都在人牙髓細胞中有表達,Dlx3高表達能促進DKK1基因的表達,同時下調Wnt/β-actin通路靶基因c-myc及clyclin D1的表達,siRNA沉默DKK1減弱Dlx3對牙髓細胞的增殖的抑制作用。結論：Dlx3抑制牙髓細胞增殖由DKK1介導。 2DKK1基因啟動子序列中DI×3結合位點的預測 使用Genebank數據庫查找人DKK1基因5’側翼區(qū)-2000～+389區(qū)域DNA序列,手工檢索Dlx3結合位點TAATT/AATTA,探測轉錄因子在基因調控區(qū)域的結合位點。然后通過構建含有不同長度DKK1基因啟動子片段的重組報告質粒進行雙熒光素酶檢測,比較其活性變化從而確定轉錄調控區(qū)。結果：在DKK1啟動子上游2000bp區(qū)域發(fā)現了12個Dlx3潛在結合位點。一系列熒光素酶表達載體瞬時轉染293細胞后,分析這些表達載體熒光素酶表達活性發(fā)現DKK1的轉錄調控關鍵元件位于轉錄起始點上游-1656to-1245區(qū)域。結論：Dlx3對DKK1基因有啟動活性。 3DI×3與DKK1基因啟動子結合的體內研究 通過染色體免疫沉淀技術(CHIP)研究轉錄因子Dlx3在體內是否可以與DKK1基因啟動子結合,用anti-Dlx3抗體沉淀染色體DNA,人IgG抗體做對照,PCR分析沉淀結果。結果：在體內,Dlx3可以結合到DKK1基因啟動子上游1656bp至1245bp區(qū)域。結論：Dlx3在體內能夠和DKK1基因啟動子1656bp至1245bp區(qū)域結合。 4DI×3對結合位點缺失型p1656載體的調控研究 通過基因定點突變技術構建Dlx3結合位點缺失型p1656載體,研究DKK1基因啟動子上Dlx3結合位點缺失后,Dlx3對DKK1轉錄活性的影響,以證實Dlx3確實是通過這些特定結合位點增強DKK1基因的轉錄活性。結果：突變Dlx3結合位點I或II對熒光素酶活性沒有顯著的影響,突變Ⅱ或Ⅲ顯著降低熒光素酶活性。結論Dlx3通過D1x3II和Dlx3Ⅲ兩個位點影響DKK1轉錄活性。
【圖文】：

圖2.1pLL3.7質粒圖譜Fig 2.1 map of pLL3.7有關試劑的配制培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母浸提物、l%Nacl)l雙蒸水中加蛋白胨lO.Og、酵母浸提物5g、Nad lO.Og。振蕩使之入雙蒸水水定容1000ml。高壓滅菌，4°C儲存。選擇性LB培養(yǎng)基在素至其終濃度lOOug/ml。培養(yǎng)基（1%胰化蛋白胨、0.5%酵母浸提物、l%Nacl、1.5%瓊脂粉ml雙蒸水中加蛋白胨2.0g、酵母浸提物l.Og、Nacl2.0g、瓊脂粉3.0完全溶解，加入雙蒸水水定容2()0ml。高壓滅菌，待冷卻至5(rC加終濃度lOOug/ml。按20ml/皿將液體倒入90mrn平皿，置室溫凝固后，。霉素（lOmg/ml，lOOx)霉素（Ig)溶于100ml無菌超純水中，0.22胖濾器過濾，分裝儲存

小約1200bp的目的片斷，與預期片斷大小一致。證明PCR法成功的從菌落中擴增出 Dlx3+CMV prom。（圖2.4)2.3.1.2. h-Dl)f3-pLL3. 7質粒經PstI、Xhol 雙酵切及Hindlll 單酵切結果h-Dlx3-pLL3.7質粒經PstI、Xhol酶切、Hindlll單酶切電泳后片斷大小正確，證明Dlx3己經進入載體pLL3.7中。（圖2.4)2. 3. 1. 3 h-Dlx3-pLL3. 7質粒的測序對該重組質粒h-Dlx3-pLL3.7進行DNA測序，，測序結果正確(圖2.5)2. 3. 2病毒包裝2. 3. 2. 1共轉染48小時后293FT細胞GFP觀察重組病毒共轉染48小時后，熒光倒置顯微鏡下觀察到293FT細胞中有綠焚光，為報告基因GFP的表達，表明共轉染成功。（圖2.6)2. 3. 2. 2人牙趟細胞細胞被Lenti-Dlx3感染72小時后的觀察37
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R781

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3 莊Y

本文編號：2616015