發(fā)布時(shí)間：2020-04-05 20:03

【摘要】： 目前,牙周疾病引起的牙周組織缺損的治療主要包括引導(dǎo)組織再生以及應(yīng)用組織工程方法通過修復(fù)獲得牙周新附著,恢復(fù)天然牙周組織的解剖結(jié)構(gòu)和支持組織。 組織工程的基本方法是將體外培養(yǎng)擴(kuò)增的正常組織細(xì)胞種植于天然的或人工合成的、具有良好的生物相容性和生物降解性的細(xì)胞外基質(zhì)材料上,經(jīng)過一段時(shí)間的培養(yǎng),將這種細(xì)胞生物材料復(fù)合體植入機(jī)體,以形成新的具有其原來特殊功能和形態(tài)的相應(yīng)組織和器官,達(dá)到修復(fù)創(chuàng)傷和重建功能的目的。有研究報(bào)道[1],以牙周膜細(xì)胞為種子細(xì)胞,利用組織工程方法成功修復(fù)牙周組織。 研究表明體外培養(yǎng)的牙囊細(xì)胞在一定的誘導(dǎo)條件作用下可以向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞的表型分化[2]。那么以牙囊細(xì)胞為種子細(xì)胞是否可以修復(fù)牙周組織缺損呢?聯(lián)合應(yīng)用BMP-2和地塞米松是否能促進(jìn)牙囊細(xì)胞體內(nèi)成骨作用呢?目前尚無報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)首先觀察了BMP-2、地塞米松以及二者聯(lián)合作用對(duì)大鼠牙囊細(xì)胞體外增殖和分化能力的影響。將不同誘導(dǎo)條件下的牙囊細(xì)胞與β-磷酸三鈣進(jìn)行體外復(fù)合,觀察了細(xì)胞在支架材料表面的增殖與貼附情況,并將其植入免疫缺陷小鼠體內(nèi),觀察BMP-2和地塞米松聯(lián)合作用是否能夠增強(qiáng)牙囊細(xì)胞在體內(nèi)向成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化能力。本研究的內(nèi)容如下: 第一部分:大鼠牙囊細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定 目的:體外培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞(RDFCs),鑒定其細(xì)胞來源及表型,為牙周組織再生的研究提供可靠的種子細(xì)胞來源。方法:選擇出生后6-7d SD仔鼠,分離上、下頜第一、第二磨牙牙胚,取牙囊組織進(jìn)行原代和傳代培養(yǎng)。通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長情況;波形絲蛋白(Vimentin,VIM)和角蛋白(Cytokeratin,CK)鑒定其細(xì)胞來源;免疫組化染色技術(shù)檢測細(xì)胞牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(dentin matrix protein1,DMP1)、骨橋蛋白(osteopontin,OPN)、骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、I型膠原(type I collagen,CoL-I)、III型膠原(typeIII collagen,CoL-III)及纖維連接蛋白(fibronectin,FN)的表達(dá)。結(jié)果:細(xì)胞形態(tài)呈多形性,有長梭形,紡錘形、不規(guī)則三角形等,波形絲蛋白染色陽性,角蛋白染色陰性。免疫組化染色顯示DMP1陰性表達(dá),OPN、BSP、CoL-I、CoL-III、FN在胞漿中呈不同程度的陽性表達(dá)。結(jié)論:大鼠牙囊細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì),具有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征及成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞表型特征,可將牙囊細(xì)胞作為種子細(xì)胞用于牙周組織工程的再生研究。 第二部分:BMP-2和地塞米松對(duì)體外培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞生物學(xué)特性的影響 目的:觀察BMP-2、地塞米松、BMP-2/地塞米松聯(lián)合作用對(duì)體外培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞增殖、分化的影響。方法:取生長狀態(tài)良好的第3代大鼠牙囊細(xì)胞,血清饑餓同步化后,分別加入含BMP-2(100ng/ml)、地塞米松Dex (10-8mol/ml)、BMP-2(100ng/ml)+地塞米松(10-8mol/ml)的DMEM培養(yǎng)液,誘導(dǎo)1d、3d、5d后,利用四唑鹽比色法(MTT)檢測不同誘導(dǎo)條件下對(duì)大鼠牙囊細(xì)胞增殖影響。通過堿性磷酸酶(ALP)檢測試劑盒、鈣化結(jié)節(jié)染色、RT-PCR檢測DMP-1、DSPP、BSP、OCN、Col I基因表達(dá)的方法,分別檢測不同誘導(dǎo)條件下對(duì)大鼠牙囊細(xì)胞分化的影響。結(jié)果:BMP-2、地塞米松分別誘導(dǎo)均能促進(jìn)牙囊細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)3天后BMP-2作用最為顯著,地塞米松則在第1天時(shí)促增殖作用最強(qiáng),其后逐漸降低,然而BMP-2/地塞米松聯(lián)合作用在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均能顯著促進(jìn)牙囊細(xì)胞的增殖。此外,地塞米松對(duì)牙囊細(xì)胞的促分化作用強(qiáng)于BMP-2,當(dāng)兩者聯(lián)合作用時(shí)促分化能力最強(qiáng)。結(jié)論: BMP-2、地塞米松均能促進(jìn)牙囊細(xì)胞增殖與分化,然而兩者聯(lián)合作用促增殖和分化的能力最為顯著,提示其在牙周組織工程中的應(yīng)用前景。 第三部分:BMP-2和地塞米松作用的大鼠牙囊細(xì)胞復(fù)合β-磷酸三鈣生物陶瓷的實(shí)驗(yàn)研究 目的:以BMP-2和地塞米松誘導(dǎo)的大鼠牙囊細(xì)胞作為種子細(xì)胞,β-磷酸三鈣作為細(xì)胞支架材料,體外構(gòu)建細(xì)胞生物材料復(fù)合體,觀察大鼠牙囊細(xì)胞在β-磷酸三鈣生物陶瓷材料的貼附、增殖情況。方法:收集培養(yǎng)的第3代RDFCs,血清饑餓同步化后,細(xì)胞分為四組,分別為BMP-2、Dex、BMP-2+Dex誘導(dǎo)組及空白對(duì)照組。誘導(dǎo)3d后,將密度為4×106/ml的細(xì)胞懸液0.1ml均勻接種到預(yù)制好的β-TCP支架材料上,分別于體外培養(yǎng)3d、7d取細(xì)胞材料復(fù)合體,通過細(xì)胞計(jì)數(shù),掃描電子顯微鏡觀察細(xì)胞在材料表面的貼附、增殖情況。結(jié)果:細(xì)胞計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn),7d時(shí)BMP-2+Dex誘導(dǎo)組細(xì)胞數(shù)量顯著高于BMP-2誘導(dǎo)組、Dex誘導(dǎo)組(p0.01)。掃描電鏡觀察,β-TCP表面呈多孔三維立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。細(xì)胞接種3 d和7d時(shí),單位面積內(nèi)BMP-2+Dex誘導(dǎo)組細(xì)胞數(shù)量均明顯高于BMP-2誘導(dǎo)組、Dex誘導(dǎo)組、對(duì)照組。結(jié)論:β-磷酸三鈣具有良好的生物相容性,利于大鼠牙囊細(xì)胞的貼附和生長,證明了BMP-2和地塞米松聯(lián)合作用促進(jìn)大鼠牙囊細(xì)胞的增殖、分化的協(xié)同效應(yīng),為進(jìn)一步使用BMP-2和地塞米松誘導(dǎo)大鼠牙囊細(xì)胞,并與β-磷酸三鈣生物陶瓷復(fù)合后體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。 第四部分:BMP-2和地塞米松誘導(dǎo)后大鼠牙囊細(xì)胞/β-磷酸三鈣生物陶瓷復(fù)合體在免疫缺陷鼠體內(nèi)成骨作用的研究 目的:觀察BMP-2、地塞米松、BMP-2+地塞米松對(duì)大鼠牙囊細(xì)胞在體內(nèi)分化能力的影響。方法:將經(jīng)BMP-2、Dex、BMP-2+Dex誘導(dǎo)后的牙囊細(xì)胞與β-TCP生物陶瓷支架材料復(fù)合后,移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)8周,取移植物進(jìn)行HE染色及Masson染色觀察。結(jié)果:HE及Masson染色結(jié)果均表明,BMP-2/Dex聯(lián)合誘導(dǎo)組移植物可見骨組織及類骨質(zhì)形成,并可見血管長入。BMP-2誘導(dǎo)組也可見少量成骨組織。而Dex誘導(dǎo)組、未誘導(dǎo)組及空白對(duì)照組均未見骨組織及類骨質(zhì)形成,但在材料孔隙周圍可見細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)成分。結(jié)論:BMP-2/地塞米松協(xié)同誘導(dǎo)的大鼠牙囊細(xì)胞與β-TCP生物陶瓷復(fù)合后,在體內(nèi)能分化成為成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞,并形成骨樣組織。為牙囊細(xì)胞/生物材料復(fù)合體修復(fù)牙周組織缺損提供理論依據(jù)。
【圖文】：

BSP F 5’-ACAGCTGACGCGGGAAAG TTG-3’,R 5’-ACCTGCTCATTTTCATCCACTTC-3’;167bpOCN F5’-ATGAGGACCCTCTCTCTGCTC-3’,R 5’-CTAAACGGTGGTGCCATAGAT-3’;306 bpCol I 5’- CGTGACCAAAAACCAAAAGTG C -35’-GGGGTGGAGAAAGGAACAGAAA-3’;186bpβ-Actin F5’－TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC－3’R5’－TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG－3’346bp計(jì)學(xué)處理采用 SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析相關(guān)數(shù)據(jù)(單樣本 t 檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)有顯著性差異。果 BMP-2、Dex、BMP-2+Dex 分別對(duì)體外培養(yǎng)大鼠牙囊細(xì)胞堿影響的時(shí)間效應(yīng)7080未誘導(dǎo)BMP-2 *

的數(shù)量及面積明顯存在顯著的差異。其中 BMx 誘導(dǎo)組與未誘導(dǎo)組相比，其礦化結(jié)節(jié)形成量均存在外，BMP-2+Dex 誘導(dǎo)組礦化結(jié)節(jié)形成量明顯大于 BM。然而，，BMP-2 單獨(dú)誘導(dǎo)組與 Dex 單獨(dú)誘導(dǎo)組間性差異(p>0.01)(圖 2-3)。達(dá)的檢測R 產(chǎn)物電泳圖(圖 2-4)顯示：未經(jīng)誘導(dǎo)的牙囊細(xì)胞不表及成骨/成牙骨質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子。BMP-2 誘導(dǎo)的牙囊細(xì)胞標(biāo)志分子 BSP、OCN 及 CoL-I。然而地塞米松、OCN 及 CoL-I 的表達(dá)明顯強(qiáng)于 BMP-2 誘導(dǎo)組。此合誘導(dǎo)組在這三種基因表達(dá)最為顯著。各組細(xì)胞均不分子 DSPP 及 DMP-1mRNA。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R78

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 侯衛(wèi)坪,郭希民;組織工程在泌尿外科重建中的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).泌尿系統(tǒng)分冊;2002年04期

2 ;關(guān)于舉辦《組織工程在口腔醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用》研討班的通知(第一輪)[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2002年03期

3 宋強(qiáng),史嘉瑋,董念國,孫宗全;組織工程心臟瓣膜研究進(jìn)展[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2003年04期

4 姚德鴻;男科學(xué)組織工程研究前景[J];中華男科學(xué);2003年05期

5 張蕾,劉肖珩,陳槐卿;韌帶組織工程研究進(jìn)展[J];生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志;2004年04期

6 胡冰,劉怡,王松靈;從細(xì)胞到器官——牙組織工程任重而道遠(yuǎn)[J];上�？谇会t(yī)學(xué);2005年02期

7 楊嗣星;申復(fù)進(jìn);王玲瓏;;組織工程化尿道研究現(xiàn)狀與前景[J];中華泌尿外科雜志;2006年12期

8 ;第二屆全國組織工程、干細(xì)胞與神經(jīng)再生學(xué)術(shù)會(huì)議在南通召開[J];南通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年01期

9 Cebotari S.;Lichtenberg A.;Tudorache I.;徐永城;;自體祖細(xì)胞組織工程人類心臟瓣膜的臨床應(yīng)用[J];世界核心醫(yī)學(xué)期刊文摘(心臟病學(xué)分冊);2007年01期

10 王莉莎;;我眼中的組織工程[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2007年35期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳馨;邱凱;劉建偉;萬昌秀;;組織工程用三維基質(zhì)水凝膠的初步研究[A];第九屆全國生物材料學(xué)術(shù)會(huì)議（CBMS-9）論文集[C];2002年

2 張西正;;生物力學(xué)在組織工程中的應(yīng)用[A];第九屆全國生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 白曉峰;田衛(wèi)東;陳希哲;;組織工程血管化的相關(guān)研究[A];2004年中國口腔頜面修復(fù)重建外科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2004年

4 李雪盛;孫建軍;姜偉;劉肖;;組織工程化緩釋BMP-2聽骨贗復(fù)物聽泡植入對(duì)豚鼠耳蝸功能的影響[A];2010全國耳鼻咽喉頭頸外科中青年學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2010年

5 周呈文;王常勇;Descamps Michel;盧建熙;;磷酸鈣多孔生物陶瓷作為組織工程支架的應(yīng)用研究[A];第九屆全國生物材料學(xué)術(shù)會(huì)議（CBMS-9）論文集[C];2002年

6 魏清榮;萬昌秀;劉建偉;趙強(qiáng);;組織工程用牛心包材料體外降解規(guī)律初步研究[A];第九屆全國生物材料學(xué)術(shù)會(huì)議（CBMS-9）論文集[C];2002年

7 楊德業(yè);張懷勤;季亢挺;黃曉燕;徐力辛;;內(nèi)皮祖細(xì)胞在制備組織工程血管中的角色[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病分會(huì)第八次全國心血管病學(xué)術(shù)會(huì)議匯編[C];2004年

8 古松鋼;許建衡;;干細(xì)胞與組織工程研究的新進(jìn)展[A];2005'中國修復(fù)重建外科論壇論文匯編[C];2005年

9 孫慶蘭;張西正;張華;李瑞欣;郭勇;張燕;;組織工程血管支架材料的研究進(jìn)展(綜述)[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第29屆學(xué)術(shù)年會(huì)暨首屆生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2009年

10 蔡紹皙;盧曉;王遠(yuǎn)亮;王紅兵;潘君;葉志義;黃豈平;秦建;吳澤志;;組織工程的一組基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究:細(xì)胞與支撐介質(zhì)間的相互作用[A];“力學(xué)2000”學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2000年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 本報(bào)記者 汪敏華;組織工程：再造器官可能圓夢[N];解放日報(bào);2001年

2 丁香;成人干細(xì)胞的突破——首次組織工程氣管移植成功[N];中國醫(yī)藥報(bào);2008年

3 沈英甲;組織工程：新的醫(yī)學(xué)奇跡[N];中國中醫(yī)藥報(bào);2001年

4 記者　 邱曙東;上海正開展兔子膀胱修復(fù)實(shí)驗(yàn)[N];解放日報(bào);2006年

5 記者 張建松;上海夢想“掏心換肝”[N];新華每日電訊;2001年

6 本報(bào)記者 王春 特約通訊員 李佳;探訪組織工程“夢工廠”[N];科技日報(bào);2005年

7 記者 張建國;首屆生物材料與組織工程產(chǎn)品質(zhì)量控制國際研討會(huì)舉行[N];中國醫(yī)藥報(bào);2009年

8 記者 毛黎;美找到獲得組織工程血管新途徑[N];科技日報(bào);2007年

9 本報(bào)記者 吳潔;為實(shí)現(xiàn)“人體配件工廠”的夢想[N];科技日報(bào);2002年

10 本報(bào)記者 唐聞佳;“一只假耳朵,騙取三個(gè)億”？[N];文匯報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 周曉東;胎盤基質(zhì)干細(xì)胞骨向分化及生物反應(yīng)器構(gòu)建骨組織的修復(fù)效果[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

2 孫曉紅;種植施萬細(xì)胞的脫細(xì)胞同種異體神經(jīng)移植物修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

3 戚孟春;BMP-7基因修飾的自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)大鼠下頜牽張成骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];四川大學(xué);2005年

4 鄭毅雄;人骨膜間質(zhì)祖細(xì)胞作為組織工程種子細(xì)胞的分子特征研究[D];浙江大學(xué);2006年

5 唐月軍;納米增韌（HA-ZrO_2系）生物復(fù)合多孔陶瓷的制備及其頜骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

6 高峰;組織工程補(bǔ)片修補(bǔ)犬腹主動(dòng)脈的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2003年

7 符彥基;骨形成蛋白-7基因修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)腎缺血再灌注損傷修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];南昌大學(xué);2008年

8 吳志偉;人胚雪旺細(xì)胞組織工程神經(jīng)的構(gòu)建[D];復(fù)旦大學(xué);2004年

9 顧春虎;去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的初步實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2005年

10 張微波;牙髓干細(xì)胞體外分化能力的研究[D];武漢大學(xué);2005年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 常秀梅;組織工程方法構(gòu)建牙周組織的實(shí)驗(yàn)研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2005年

2 葉國;大鼠牙囊細(xì)胞體外培養(yǎng)方法的改良及生物學(xué)特性的初步研究[D];四川大學(xué);2007年

3 常慶;AdLacZ基因修飾的山羊耳軟骨細(xì)胞復(fù)合F127構(gòu)建組織工程化軟骨的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘇州大學(xué);2007年

4 陳偉豪;絲素蛋白膜修復(fù)犬尿道缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

5 李娜;組織工程中應(yīng)變對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

6 劉超;人骨髓干細(xì)胞成牙潛能的初步研究[D];福建師范大學(xué);2005年

7 劉偉鵬;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合PLGA支架修復(fù)組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究[D];江西醫(yī)學(xué)院;2005年

8 張兆清;復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

9 李軍杰;膠原海綿為支架體外構(gòu)建工程化心肌組織的實(shí)驗(yàn)研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

10 殷迪;人羊膜上皮細(xì)胞與肌基膜管支架相容性的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2615469