【摘要】：口腔種植學作為一門新興學科，近些年來一直受到人們的關注。種植牙被稱為“人類的第三副牙齒”，并成為目前最為理想的缺牙修復方式。但許多全身系統(tǒng)性疾病，例如：心血管疾病、糖尿病、骨代謝性疾病、出血性疾病、自身免疫性疾病等，它們經常導致種植修復的最終失敗，極大地限制了種植技術的推廣。尤其隨著人們生活水平的提高、飲食結構的改變，糖尿病特別是2型糖尿病患病人數(shù)呈逐年上升趨勢。基于這一現(xiàn)狀，我們課題組進行了前期的動物實驗，證實了種植失敗的主要原因是種植體周圍不能形成良好的骨性結合，指出了成骨細胞的形成與分化是影響骨結合的關鍵所在，所以我們很有必要對2型糖尿病患者的牙槽骨成骨細胞的生物學特性從細胞生物學角度進行初步研究，用具有理想控釋系統(tǒng)的微球局部持續(xù)釋放多肽性生長因子進行干擾，分析其對成骨細胞的誘導分化作用，為下一步臨床就如何提高2型糖尿病患者種植牙成功率這一棘手問題提供理論和實驗基礎。研究內容和目的： 臨床中，采集接受口腔種植的2型糖尿病患者和正常患者牙槽骨剩余骨碎屑，分別進行體外培養(yǎng)，分析生物學特性，進行對比研究，證實2型糖尿病患者牙槽骨成骨細胞的生物學活性較正常人差，為后續(xù)研究提供實驗載體。 利用具有良好生物相容性、可降解性，且無毒副作用的生物聚合物PLGA，采用水/油/水（W/O/W）雙層乳液法，包裹多肽性生長因子rhIGF-1，制備成具有持續(xù)釋放能力的緩釋微球，對微球的大小、形態(tài)作掃描電鏡（SEM）觀察，并作體外釋放動力學實驗，繪制其曲線，分析微球的持續(xù)釋放能力。 在同一細胞計數(shù)的情況下，PLGA包裹的rhIGF-1和安慰劑兩種微球分別加入兩組載有鈦片的2型糖尿病患者牙槽骨成骨細胞的培養(yǎng)皿中，利用rhIGF-1的持續(xù)釋放作用分析對其成骨細胞的誘導分化作用，為下一步臨床應用研究奠定實驗基礎，從而也為解決2型糖尿病患者種植牙失敗率高這一棘手問題進行有效探索。實驗方法和結果： 第一部分： 方法：無菌條件下，收集3組接受口腔種植的2型糖尿病患者和正�；颊哐啦酃鞘Ｓ喙撬樾迹捎媒M織塊法進行體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察細胞的形態(tài)，取第四代細胞用于實驗研究，堿性磷酸酶（ALP）化學染色法檢測成骨細胞的活性，茜素紅（Alizarin red）染色法進行細胞成骨特性的檢測，，噻唑藍（MTT）比色法檢測兩種細胞的增值趨勢，酶動力學的方法作堿性磷酸酶（ALP）活性定量測定，放射免疫的方法測定骨鈣素（BGP）的濃度，酶聯(lián)免疫分析（ELISA）的方法進行細胞上清液中Ⅰ型膠原（COL-Ⅰ）濃度的檢測。 結果： （1）同等培養(yǎng)條件下，二者的形態(tài)無明顯差異，但2型糖尿病牙槽骨成 骨細胞較正常人細胞生長慢、活性弱及礦化結節(jié)形成少；2型糖 尿病成骨細胞上清液中ALP、BGP及COL-Ⅰ含量均較對照組低（P 㩳0.05）。（2）2型糖尿病人的成骨細胞在含低糖的DMEM培養(yǎng)基中生長緩慢， 在其高糖培養(yǎng)基中卻生長較快，而正常成骨細胞則在低糖或高糖培 養(yǎng)基中差異不明顯。 第二部分： 方法：以rhIGF-1加蒸餾水形成W1相，Span80和PLGA作為O相，二相結合形成W1/O初乳液，最后與W2相（tween80和PVA組成）形成W1/O/W2雙層乳液，蒸發(fā)溶劑后形成所需微球。對微球作掃描電鏡分析，觀察其大小、形態(tài)以及質地是否均勻。通過累積釋放率繪制釋放動力學曲線，以觀察微球的持續(xù)釋放效能。 結果： （1）實驗所獲微球的表面形態(tài)較光滑，大小較均勻。微球粒徑約為1.4076±0.5238μm。包封率約為82.3±1.8%。 （2）從繪制的釋放動力學曲線可以看出，所得到的微球具有良好的釋放能力，開始時釋放較快，前20天累積釋放率約為84%，以后逐漸減慢，大約40天釋放完畢。 第三部分： 方法：在培養(yǎng)孔中放入鈦片，加入細胞懸液，培養(yǎng)一定時間后，取出鈦片，進行細胞非特異性熒光染色，證實兩種細胞與鈦片的貼附。在同一細胞計數(shù)的情況下，6孔培養(yǎng)板中，每孔均勻放置8枚鈦片，細胞長滿后，進行細胞計數(shù)，分析培養(yǎng)皿中兩種細胞與鈦片的結合能力。同樣方式，把rhIGF-1微球和PLGA包裹的安慰劑微球分別加入兩組載有鈦片的2型糖尿病人牙槽骨成骨細胞的培養(yǎng)皿中（因放入8枚鈦片過于擁擠，不利于細胞的觀察和換液，改置每孔放入5枚鈦片），細胞爬滿后計數(shù)，證實rhIGF-1微球對鈦片上細胞的誘導作用。 結果： （1）非特異性熒光染色顯示兩種細胞均勻地貼附在鈦片上，可清楚地觀察到細胞核和細胞膜。 （2）經細胞計數(shù)，可以計算出兩種細胞與鈦片的貼附數(shù)量，2型糖尿病人牙槽骨成骨細胞較正常人少，二者有統(tǒng)計學意義（P㩳0.05）。 （3）2型糖尿病人牙槽骨成骨細胞加入兩種微球后，經細胞計數(shù)，加入rhIGF-1微球的糖尿病人成骨細胞數(shù)較加入安慰劑微球的糖尿病人成骨細胞數(shù)多，二者存在統(tǒng)計學意義（P㩳0.05），證實了PLGA包裹的rhIGF-1微球對2型糖尿病人牙槽骨成骨細胞的誘導分化作用。 研究結論： （1）2型糖尿病病人牙槽骨成骨細胞可以在體外成功培養(yǎng)，雖有正常成骨細胞的形態(tài)和生物學特性，但細胞生長緩慢，特征性分泌物含量仍較正常成骨細胞低。 （2）制備的微球其大小、包封率及釋放能力均較為理想，且有良好的生物相容性，可以作為促進成骨細胞分化的良好控釋系統(tǒng)。 （3）證實了PLGA是一種理想的載體，與細胞無任何不良反應。PLGA包裹的rhIGF-1微球對2型糖尿病人牙槽骨成骨細胞的誘導分化作用，為臨床提高2型糖尿病患者種植體植入獲得良好骨結合提供了有效手段。
【圖文】：

的蛋白酶消化骨基質, 最后形成骨陷窩； 成骨過程為成骨細胞移行于被吸收部位, 分泌骨基質, 最后骨基質礦化形成新骨。破骨和成骨的這種平衡是保持正常骨量的關鍵（如圖4）。而其中的生物礦化，是不同類型的組織、細胞、細胞器和活質分子共同參與協(xié)調的一種代謝過程，在礦化過程中，骨髓細胞被分離、培養(yǎng)和誘導分化為軟骨細胞或成骨細胞。圖4：骨改建過程示意圖[59]3. 成骨細胞骨形成過程主要經歷四個階段：第一階段：成骨細胞的增值期即成骨細胞數(shù)量的增長期，其間形成多層細胞，合成分泌COL-1，最終礦化形成鈣結節(jié)。I型膠原構成骨組織蛋白框架，其合成與分解是骨形成與吸收的生物學特性指標。與增值有關的基因有c-myc、c-fos、c-jun、H4組蛋白等[55,60]。第二階段：細胞外基質成熟分化期，在增值晚期，與其相關的基因表達開始下降

這些被激活的受體發(fā)生信號通路，最終調節(jié)一系列的生物應答反應。2型IGF受體（IGF-2R）和高親和性的IGF結合蛋白家族（IGFBPs）調節(jié)著IGF-1、IGF-2結合到受體的活性(如圖5)。這些組成成分控制和決定著許多生物學效應，包括細胞的生長、增值、分化、凋亡和遷移[67、68]。IGF-1是一種單鏈的堿性多肽，由70個氨基酸和三個二硫鍵組成[69、70]，分子量為7.646kD，等電點為pH8.6。當腦垂體前葉分泌生長激素，在數(shù)分鐘之內，即可促進肝細胞合成分泌為IGF-1，因此IGF-1主要由肝臟作為內分泌激素產生[71];有一少部分由成骨細胞或軟骨細胞作為旁分泌產生[72]，分子結構類似于胰島素
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R587.1;R782.2

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本文編號：2611117