【摘要】：目的:顳下頜關(guān)節(jié)炎癥(Temporomandibular Joint Inflammation,TMJI)導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的退化性疾病,表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、滑膜炎癥、軟骨的進(jìn)行性退變及軟骨下骨的重塑等。TMJI病因復(fù)雜、并與多因素相關(guān)。研究證明,神經(jīng)因素對顳下頜關(guān)節(jié)炎癥以及痛覺過敏的發(fā)生、發(fā)展與預(yù)后起到重要作用,并且多種細(xì)胞因子和疼痛相關(guān)因子參與這種炎癥反應(yīng)和痛覺過敏過程。Toll樣受體4(Toll-like Receptors4,TLR4)是一種模式識別受體,與許多免疫和炎癥性疾病的發(fā)生及發(fā)展相關(guān)。TLR4信號通路在神經(jīng)病理性疼痛、糖尿病、肥胖等多種疾病中逐漸成為新的研究熱點。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),初級感覺神經(jīng)元中TLR4的表達(dá),可以發(fā)揮神經(jīng)元潛在的先天性免疫監(jiān)測功能,對急性傷害反應(yīng)應(yīng)答和維持慢性疼痛狀態(tài)均具有重要的作用。本課題組前期研究結(jié)果表明,三叉神經(jīng)節(jié)(Trigeminal Ganglion,TG)中的巨噬細(xì)胞參與口頜面部炎癥與神經(jīng)損傷反應(yīng),但我們對其作用機(jī)制還了解甚少。最新的研究表明,TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對巨噬細(xì)胞的遷移及表型改變具有重要的影響作用,且靶向調(diào)控TLR4可能成為操縱巨噬細(xì)胞的有效手段。因此本實驗利用完全弗氏佐劑(Freund’s Adjuvant Complete,CFA)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射法建立大鼠顳下頜關(guān)節(jié)炎動物模型,觀察大鼠TMJI過程中,巨噬細(xì)胞、TLR4及其信號通路在TG中的動態(tài)表達(dá)變化,探討神經(jīng)系統(tǒng)TLR4信號通路參與TMJI神經(jīng)免疫反應(yīng)的作用,并進(jìn)一步解析其可能機(jī)制,為TMJI的治療提供新的參考靶點。材料和方法:選取由大連醫(yī)科大學(xué)重大疾病基因工程模式動物研究所提供的成年雄性Sprague-Dawley大鼠33只隨機(jī)分組,于顳下頜關(guān)節(jié)上腔注射CFA,建立TMJI實驗動物模型,正常對照組(na?ve組)大鼠不做任何處理。建模后72小時至6周,分別選取5個時間點進(jìn)行觀察檢測。用于組織切片組大鼠經(jīng)多聚甲醛磷酸鹽緩沖液灌流固定后,制備TG及TMJ連續(xù)組織冰凍切片。用于PCR實驗組大鼠按TRIZOL-A+總RNA提取步驟提取TG組織總RNA。應(yīng)用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、RT-q PCR(Real time quantitative PCR)等實驗方法分別檢測TMJI病理進(jìn)程,TG中CD206、TLR4、My D88、TRIF、NF-κB、TNF-a等因子的蛋白及基因表達(dá)。結(jié)果:1.組織病理學(xué)檢查可見,關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射CFA后,TMJ出現(xiàn)進(jìn)行性組織病理變化。注射CFA 72h后,TMJ滑膜增生,且滑膜皺褶明顯增多;6w后髁突軟骨細(xì)胞層次紊亂,局部纖維軟骨剝脫,出現(xiàn)骨質(zhì)缺損。提示成功構(gòu)建大鼠TMJI模型。但是,錐體束CT(CBCT)影像學(xué)檢查結(jié)果顯示,CFA誘發(fā)TMJI后6w后,髁突表面未見明顯的骨質(zhì)缺損。2.免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,na?ve組和實驗組大鼠TG內(nèi)都存在CD206標(biāo)記的M2型巨噬細(xì)胞,散在分布于TG內(nèi),多圍繞于神經(jīng)元細(xì)胞體的周圍。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,CFA誘發(fā)TMJI后,單位面積內(nèi)CD206免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著增加,在CFA致炎72h后升高,2w達(dá)到峰值,持續(xù)至4w,于6w后趨于正常水平。3.TLR4免疫組化標(biāo)記結(jié)果顯示,TLR4陽性信號主要分布在TG的中、小型感覺神經(jīng)元的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中。TLR4陽性細(xì)胞率統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,CFA誘發(fā)TMJI后,TLR4免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量顯著增加,在72h達(dá)到峰值,持續(xù)至2w,于4w時恢復(fù)至正常水平,6w時再次顯著增加。4.My D88免疫組化標(biāo)記結(jié)果顯示,My D88陽性信號主要分布在中、小型感覺神經(jīng)元的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿中。My D88陽性細(xì)胞率統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示,CFA致炎72h后,My D88免疫陽性神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)顯著增加,在2w達(dá)到峰值,持續(xù)至4w,于6w時恢復(fù)至正常水平。5.TG神經(jīng)元中TLR4與My D88表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,TLR4、My D88之間相關(guān)性r=0.392。r大于0.3小于0.5,兩變量具有低度相關(guān)性且具有統(tǒng)計學(xué)意義。6.RT-q PCR檢測結(jié)果顯示,CFA致炎后72h到6w,TG內(nèi)TLR4 m RNA的表達(dá)均顯著高于正常對照組,與na?ve組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.0001);同時,CFA致炎后72h及6w,TG內(nèi)m RNA水平的NF-κB表達(dá)高于正常對照組,而TNF-α的表達(dá)在CFA致炎后2w至6w,均高于正常對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。而TG內(nèi)TRIF m RNA的表達(dá)僅在6w時高于na?ve組(p0.01)。結(jié)論:1.三叉神經(jīng)節(jié)TLR4信號通路參與TMJI神經(jīng)免疫反應(yīng)。2.TMJI病理進(jìn)程,TG中TLR4的激活主要通過My D88依賴途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.TG中M2型巨噬細(xì)胞參與TMJI神經(jīng)炎癥及修復(fù)過程。
【圖文】：

血后緩慢注射50 μLCFA 乳化液（CFA：生理鹽水，，1:1；Sigma 公司）于關(guān)節(jié)上腔，正常對照組（na ve組）不做任何處理。圖1. 大鼠TMJI動物模型建立示意圖A：TMJI模型建立過程示意圖：以外耳眼眶連線上1 mm與耳前2 mm交點處為進(jìn)針點進(jìn)針。B：大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突實物圖及進(jìn)針點示意圖。

大連醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文結(jié) 果一、 大鼠 TMJI 動物模型的成功建立1. HE 組織病理檢查結(jié)果HE 染色結(jié)果顯示（圖 2），顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射 CFA 后 TMJ 出現(xiàn)進(jìn)行性病理變化。CFA 注射 72 h 后，顳下頜關(guān)節(jié)腔內(nèi)滑膜增生，滑膜皺褶增多；6 w 后軟骨細(xì)胞層次紊亂，局部纖維軟骨剝脫，骨質(zhì)缺損，提示 CFA 誘發(fā)大鼠 TMJI 及骨性關(guān)節(jié)炎。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R782.6

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 ;Emerging role of Toll-like receptors in the control of pain and itch[J];Neuroscience Bulletin;2012年02期

本文編號：2605400