發(fā)布時(shí)間：2017-03-21 23:07

  本文關(guān)鍵詞：慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表達(dá)及其臨床意義分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：口腔組織健康被世界衛(wèi)生組織列為人類健康的十項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)之一,其中牙周病是口腔的兩大類主要疾病之一。慢性牙周炎(chronic periodontitis)是最為常見的一類牙周病,約占95%以上,臨床上常表現(xiàn)為牙周袋形成、附著喪失和牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng),最后可導(dǎo)致牙齒喪失,是我國成年人失牙的首要原因。慢性牙周炎是一種多因素作用的疾病,其病變過程涉及復(fù)雜的微生物和宿主因素的相互作用,宿主對細(xì)菌侵襲的應(yīng)答反應(yīng)是決定其發(fā)生與否,病情嚴(yán)重程度、范圍大小、發(fā)展速度等的重要因素,目前其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。唾液中含有大量血液中存在的分子物質(zhì),如蛋白、RNA、DNA、病毒顆粒等。所以唾液被喻為“人體健康的一面鏡子”,能提示人體的多種疾病狀態(tài),如感染性疾病、腫瘤和心腦血管疾病等。近年,有關(guān)唾液檢測與疾病診斷的研究逐漸增加,而唾液miRNA作為一種新的檢測標(biāo)志物逐漸受到研究者的關(guān)注。有研究報(bào)道組織、血漿和唾液三者具有相似的miRNA表達(dá)譜,即若干個(gè)同種miRNA在患者的病變組織、血液和唾液中的表達(dá)同時(shí)發(fā)生了顯著的變化。目前對于唾液中miRNA在慢性牙周炎中的表達(dá)國內(nèi)外研究較少見。miRN A是一類內(nèi)源性、序列高度保守、大小約22個(gè)核苷酸的單鏈非編碼小IRNA。miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平對基因的表達(dá)進(jìn)行負(fù)調(diào)控,其原理是通過與基因mRNA3'非轉(zhuǎn)錄區(qū)(3'UTR)互補(bǔ)配對,導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。隨著RNA組學(xué)以及生物信息學(xué)預(yù)測的不斷發(fā)展,目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)530余種miRNA,其在人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。研究人員在口腔鱗癌患者唾液中檢測出多種穩(wěn)定存在的miRNA分子,采用熒光定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-200a和miRNA-125a在口腔鱗癌患者唾液中表達(dá)顯著降低。吳偉東等通過檢測食道癌患者和健康對照者唾液中miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn),食道癌患者唾液中miRNA-144存在高表達(dá),可作為早期診斷食道癌的基因標(biāo)志物。Xie等研究發(fā)現(xiàn)唾液中miRNA-3679-5p和miRNA-940可作為胰腺癌的潛在非侵入性診斷標(biāo)志物。已明確miRNA在免疫系統(tǒng)中起著調(diào)節(jié)作用,其中miRNA-146a是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的與免疫炎癥密切相關(guān)的miRNA。它是一個(gè)典型的多功能基因,在固有免疫中作用重大,參與免疫、炎癥、造血和腫瘤等多種生理病理過程的發(fā)生、發(fā)展。人類miRNA-146由22個(gè)核苷酸組成,包括I]iRNA-146a和miRNA-146b兩種形式,miRNA-146a位于人體的第5號染色體的LOC285628基因上,成熟序列位于第二外顯子上。其中miRNA-146a在單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種免疫和炎癥細(xì)胞中高度表達(dá)。近期,Xie等通過基因芯片分析技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn),牙周炎患者牙齦組織中包含miRNA-146a在內(nèi)的一些miRN A表達(dá)上調(diào)。此外,研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-146a及其靶蛋白基因的多態(tài)性與慢性牙周炎易感性相關(guān)。根據(jù)以上內(nèi)容,我們推測miRNA-146a可能參與了慢性牙周炎的發(fā)病過程,但其機(jī)制還尚不清楚。本研究擬通過莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測慢性牙周炎患者及健康對照者唾液中miRNA-146a表達(dá)水平,分析其表達(dá)水平與牙周炎癥程度的關(guān)系；通過對慢性牙周炎患者實(shí)施牙周基礎(chǔ)治療,對比治療前后唾液中miRNA-146a的水平,并探討其與牙周臨床指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的關(guān)系,為牙周病基礎(chǔ)治療效果評估和病情發(fā)展預(yù)測等方面奠定基礎(chǔ)。本論文分為以下兩個(gè)部分內(nèi)容第一部分慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相關(guān)因子表達(dá)水平的檢測1.目的本研究擬通過莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測慢性牙周炎患者及健康對照者唾液中miRNA-146a表達(dá)水平的差異,分析其表達(dá)水平與牙周主要臨床指標(biāo)及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10分泌的關(guān)系,為慢性牙周炎的臨床診斷和治療提供參考。2.方法(1)研究對象：根據(jù)1999年美國牙周病分類研討會(huì)提出的慢性牙周炎的診斷標(biāo)準(zhǔn),慢性牙周炎患者(牙周炎組)選取自2012年1月至2014年5月于西南醫(yī)院口腔科就診的64例病患,其中男性38例,女性26例,平均年齡44歲。同時(shí)健康對照組選擇本院體檢的30例健康志愿者,包括男性17例,女性13例,平均年齡42歲。(2)牙周檢查及分組：詳細(xì)記錄所有研究對象牙周臨床指標(biāo)：菌斑指數(shù)(plaque index, PLI)、牙齦指數(shù)(gingival index, GI)、牙周探診深度(p robing depth,PD)和附著喪失(attachment loss, AL)。根據(jù)探診深度、牙齦指數(shù)、附著喪失、X線片顯示牙槽骨吸收程度來衡量牙周炎的程度,分組如下：①健康對照組：牙齦指數(shù)=0,無附著喪失及牙槽骨的吸收,牙周探診深度3mm,共30例。②輕度牙周炎組：牙齦指數(shù)1,附著喪失1～2 mm,牙槽骨吸收長度1/3根長,牙周探診深度gmm,牙松動(dòng)不明顯,共18例。③中度牙周炎組：牙齦指數(shù)1,附著喪失3～4mm,牙槽骨吸收長度為1/3根長～1/2根長,牙周探診深度6mm,多根牙有輕度根分叉病變,牙輕度松動(dòng),共24例。④重度牙周炎：牙齦指數(shù)1,附著喪失≥5mm,牙槽骨吸收長度1/2根長,牙周探診深度6mmm,根分叉病變明顯,牙多有松動(dòng),共22例。(3)唾液采集：清晨采用棉簽法采集受試者的唾液標(biāo)本,在唾液采集前2小時(shí)受試者需空腹,不能喝水、喝酒、喝飲料、進(jìn)食、抽煙、劇烈運(yùn)動(dòng)及情緒劇烈波動(dòng)等。采樣時(shí)受試者坐位、頭稍前傾體位,棉簽蘸檸檬酸刺激口腔唾液分泌,1.5分鐘后吐出唾液,用10ml無RNA酶離心管收集唾液標(biāo)本,立即于4℃,3000rpm,15分鐘離心取上層液體,將收集好的唾液上清凍存于_80-C備用。(4)唾液上清miRNA-146a表達(dá)檢測：吸取lml唾液上清提取和純化唾液上清中的總RNA,提取步驟參照mirVana PARIS Kit試劑盒說明書進(jìn)行。以miRNA-16作為內(nèi)參,采用莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的總RNA中的miRNA-146a反轉(zhuǎn)錄成cDNA。于-80-C凍存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物待用。在ABI StepOne Plus實(shí)時(shí)定量PCR (Real-time PCR, RT-qPCR)儀上按照SYBR Premix Ex TaqTM PCR反應(yīng)試劑盒進(jìn)行RT-qPCR檢測。反應(yīng)總體積為20μl,每個(gè)標(biāo)本做3個(gè)復(fù)孔。計(jì)算各標(biāo)本平均循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct),將miRNA-146a的Ct值減去miRNA-16 Ct值作為ACt值。采用相對定量法對RT-qPCR結(jié)果進(jìn)行分析,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化后的2-ACt值表示miRNA-146a的相對表達(dá)含量。(5)唾液上清中TNF-a, IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平的檢測：采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)法(ELISA)檢測唾液上清樣本中的TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平,操作按說明書進(jìn)行：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至ELISA反應(yīng)板中,每塊ELISA反應(yīng)板設(shè)置8孔標(biāo)準(zhǔn)孔；吸取100μl待檢樣品加入ELISA反應(yīng)板中,輕輕混勻,37℃孵育2小時(shí)；吸取100山第一抗體工作液加入ELISA反應(yīng)孔中,混勻,37℃孵育1小時(shí)；洗板機(jī)洗板,洗5次,每次45秒；洗板結(jié)束后在ELISA反應(yīng)孔加入100μl辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,輕輕混勻,37℃溫育1小時(shí)；洗板機(jī)洗板,洗5次,每次45秒；洗板結(jié)束后每孔加入底物A液和B液各50μl,輕輕混勻,37℃溫育30分鐘；加入50μl終止液,輕輕混勻；在450nm波長處測定各孔的OD值；以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫座標(biāo),相應(yīng)的OD值為縱座標(biāo)進(jìn)行曲線擬合,作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,根據(jù)擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各檢測樣本中細(xì)胞因子的含量。(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用x±s表示,組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNA-146a表達(dá)水平與PLI、GI、PD和AL臨床指標(biāo)及TNF-a, IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平的關(guān)系采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。3.結(jié)果(1)慢性牙周炎組唾液上清中miRNA-146a的表達(dá)(2.72±0.81)顯著高于健康對照組(0.82±0.36),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)輕度慢性牙周炎組唾液上清中miRNA-146a表達(dá)水平為1.92±0.44,中度牙周炎組為2.71±0.58,重度牙周炎組為3.40±0.62, miRNA-146a在輕度牙周炎、中度牙周炎、重度牙周炎之間表達(dá)呈顯著增高(P0.01)(3)慢性牙周炎組唾液上清中miRNA-146a的表達(dá)水平與菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)、牙周探診深度和附著喪失呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.752,P0.001; r=0.657, P0.001; r=0.586, P0.001; r=0.647, P0.001。(4)慢性牙周炎患者唾液上清中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8的平均值分別為9.46±6.72 pg/ml,48.20±14.97 pg/ml、6.26±4.05 pg/ml、145.97±43.68pg/ml,均顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。而IL-10水平(平均值為6.74±4.31 pg/ml)則顯著低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)慢性牙周炎組唾液上清中miRNA-146a的表達(dá)水平與唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8水平呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.516,P0.001；r=0.471, P0.001; r=0.442, P0.001; r=0.378, P0.01,與IL=10水平則呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=0.319,P0.01。4.結(jié)論(1)慢性牙周炎組及健康對照組的唾液上清中均可檢測到miRNA-146a表達(dá),前者表達(dá)水平顯著高于后者。(2)慢性牙周炎組中,隨著牙周破壞程度增加,患者唾液上清中miRNA-146a表達(dá)呈增高趨勢。(3)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表達(dá)與PLI、GI、PD和AL呈正相關(guān)性,提示其與牙周炎破壞程度密切相關(guān)。(4)慢性牙周炎患者唾液上清中miRNA-146a表達(dá)與唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8呈正相關(guān)性,與IL-10呈負(fù)相關(guān)性。第二部分牙周基礎(chǔ)治療對慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相關(guān)因子表達(dá)水平的影響1.目的采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR檢測慢性牙周炎患者在牙周基礎(chǔ)治療前后唾液上清中miRNA-146a表達(dá)情況,分析miRNA-146a表達(dá)在牙周基礎(chǔ)治療前后的變化趨勢及其與牙周炎癥程度之間的關(guān)系,探討唾液上清中miRNA-146a是否可以為監(jiān)測基礎(chǔ)治療療效的客觀指標(biāo)。2.方法：以上述64例慢性牙周炎患者為研究對象進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療,治療前對納入分析的慢性牙周炎患者進(jìn)行口腔衛(wèi)生宣教及口腔衛(wèi)生指導(dǎo),包括牙刷使用頻率及方法、牙線使用等,然后行全口超聲齦上潔治術(shù)、齦下刮治及根面平整術(shù),治療全過程在2周內(nèi)完成。治療后不給予抗生素輔助治療。囑患者治療結(jié)束后第6周末進(jìn)行牙周臨床指標(biāo)、唾液上清miRNA-146a及細(xì)胞因子TOF-a、IL-1β、IL-6、IL-8及IL-10水平復(fù)查。采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s表示,牙周基礎(chǔ)治療前后唾液中miRNA-146a的表達(dá)水平比較采用配對t檢驗(yàn),以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�；A(chǔ)治療前后miRNA-146a變化值(AmiRNA-146a)與牙周主要臨床指標(biāo)變化值及細(xì)胞因子變化值的關(guān)系采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析。3.結(jié)果(1)最終按要求完成牙周基礎(chǔ)治療后進(jìn)行復(fù)診的患者共48例。慢性牙周基礎(chǔ)治療后第6周觀察牙的P LI、GI、PD和AL均較治療前顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(2)48例治療組患者基礎(chǔ)治療前(基線)唾液上清中miRNA-146a表達(dá)為2.85±0.92,治療后第6周唾液上清中miRNA-146a表達(dá)為1.49±0.52,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)直線相關(guān)分析結(jié)果顯示,基礎(chǔ)治療前后△miRNA-146a與治療前后菌斑指數(shù)變化值(APLI)、牙齦指數(shù)變化值(AGI)、牙周探診深度變化值(APD)和附著喪失變化值(△AL)呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.412,P0.01；r=0.506,P0.001；r=0.470,P0.001：r=0.584,P0.001。(4)慢性牙周基礎(chǔ)治療后第6周唾液中TNF-a, IL-1β、IL-6和IL-8表達(dá)水平顯著降低,與治療前(基線)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(5)基礎(chǔ)治療前后AmiRNA-146a與治療前后唾液中TNF-a、IL-1β、IL-6、IL-8變化值(ATNF-a、AIL-1β、AIL-6、AIL-8)呈顯著正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為r=0.547, P0.001; r=0.416, P0.001; r=0.352, P0.01; r=0.327, P0.01,與IL=10變化值(AIL-10)則呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=0.403,P0.01。4.結(jié)論(1)牙周基礎(chǔ)治療能顯著降低慢性牙周炎患者PLI、GI、PD和AL臨床指標(biāo),提示基礎(chǔ)治療可以有效改善牙周組織的炎癥狀況。(2)慢性牙周炎患者經(jīng)基礎(chǔ)治療后唾液上清中miRNA-146a表達(dá)降低。(3)牙周基礎(chǔ)治療前后唾液上清miRNA-146a變化值與治療前后PLI.GI、PD和AL的變化值呈正相關(guān)性。(4)牙周基礎(chǔ)治療前后唾液上清AmiRNA-146a與治療前后唾液中ATNF-a, AIL-1β、AIL-6、AIL-8呈正相關(guān)性,與AIL-10呈負(fù)相關(guān)性。
【關(guān)鍵詞】：慢性牙周炎 唾液 微小RNA miRNA-146a
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-27
• 第一章 慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相關(guān)因子表達(dá)的檢測27-45
• 1. 材料與方法27-35
• 2. 結(jié)果35-40
• 3. 討論40-45
• 第二章 牙周基礎(chǔ)治療對慢性牙周炎患者唾液中miRNA-146a及相關(guān)因子表達(dá)的影響45-60
• 1. 材料與方法45-51
• 2. 結(jié)果51-55
• 3. 討論55-60
• 全文總結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-69
• 英文縮略詞69-70
• 成果70-71
• 致謝71-72

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 束蓉;;牙周病病因及治療研究進(jìn)展[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2007年06期

  本文關(guān)鍵詞：慢性牙周炎患者唾液miRNA-146a的表達(dá)及其臨床意義分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：260442