【摘要】：目的：本研究為前期本實驗室將異體同種骨髓間充質干細胞（Bone marrowmesenchymal stem cells BMSCs）懸液經山羊頸靜脈注射致急性肺栓塞發(fā)生故設計探索性的實驗，目的在于比較4℃恒溫條件下短期保存對小鼠骨髓間充質干細胞（C57-BMSCs）的細胞活性及生物學特性是否產生影響，為短期安全有效的保存BMSCs提供參考，探索使用DNA酶Ⅰ（DeoxyribonucleaseⅠ DNaseⅠ）預處理后的注射用BMSCs經尾靜脈注射至同種異體小鼠體內的移植方式，能夠起到降低直接血管內移植導致發(fā)生急性肺栓塞的風險。為將來在臨床或口腔組織工程領域應用提供安全性參考。 方法：（1）體外無菌分離培養(yǎng)純化C57-BMSCs，鑒定BMSCs的骨向、脂向分化能力，經流式對其的表面分子標志物表達程度檢測。（2）磷酸鹽的緩沖液（PhosphateBuffered Saline PBS）作為C57-BMSCs的短期儲存液，直接將BMSCs置于4℃恒溫保存，存儲0h、4h、12h、24h及48h后取試樣，鏡檢細胞、測算統(tǒng)計活細胞比例、比較增殖和分化能力。（3）對正常C57-BMSCs和DNaseⅠ預處理后C57-BMSCs懸液細胞聚集狀態(tài)及體外增殖、分化能力進行比較。（4）將體外分離、培養(yǎng)、純化后的C57-BMSCs擴增至第三代。將C57小鼠隨機分為四組：注射PBS組（n=30）、注射10U/mlDNaseⅠ-PBS組（n=30）、注射正常C57-BMSCs組（n=30）、注射DNaseⅠ預處理后C57-BMSCs組（n=30）。（5）注射PBS組與注射正常C57-BMSCs組每只小鼠以5ml/kg的比例，分別經尾靜脈注射相應劑量的PBS或本實驗室前期試驗摸索得到（3×106cell）的臨界致死劑量C57-BMSCs，取急性死亡小鼠臟器做組織學檢測，，注射PBS組做對照，觀察記錄并統(tǒng)計急性死亡率。（6）注射DNaseⅠ預處理后C57-BMSCs組，每只小鼠按5ml/kg比例注射DNaseⅠ預處理后3×106個C57-BMSCs觀察急性死亡率。 結果：（1）于4℃恒溫條件下短期保存C57-BMSCs4h、12h和24h后取樣鏡下觀察見良好的形態(tài)、活細胞占80%左右，細胞增殖、分化能力上相比于0h無統(tǒng)計學意義（P0.05）；48h取樣后鏡下見悉數(shù)視野的死細胞和細胞碎片、僅20%左右為活細胞，與0h相比細胞增殖、分化能力上存顯著性差異（P0.05）。（2）DNaseⅠ預處理不影響C57-BMSCs增殖、分化能力（P0.05）；DNaseⅠ預處理C57-BMSCs與正常C57-BMSCs相比細胞聚集成團比例顯著降低（P0.05）。（3）與注射PBS組相比，注射正常C57-BMSCs組的急性死亡率是60%、組織學檢測發(fā)現(xiàn)心肺異常并且肺血管內有異染物質，誘發(fā)了急性肺栓塞。（4）注射DNaseⅠ預處理后C57-BMSCs組的急性死亡率降為23.3%，與注射正常C57-BMSCs組相比有統(tǒng)計學差異（P0.05）。 結論：（1）4℃恒溫條件下24h內短期保存C57-BMSCs為一種簡單易行的保存方法。但是，細胞生物學特性與活性隨保存時間延長是呈逐漸下降的，并直至喪失。（2）DNaseⅠ預處理不影響C57-BMSCs的生物學特性,DNaseⅠ能夠降低經靜脈注射移植C57-BMSCs懸液中單個細胞間聚集所誘發(fā)急性肺栓塞風險的發(fā)生。為將來臨床或口腔組織工程領域的應用提供了一定的安全性參考。
【圖文】：

圖1-1 C57 小鼠骨髓間充質干細胞培養(yǎng)鏡下圖片（20×）注：a 為原代C57-BMSCs；b 為一代C57-BMSCs；c 為二代C57-BMSCs；d 為三代C57-BMSCs。圖1-2 C57-BMSCs 成骨誘導 7 天ALP、21 天茜素紅染色注：a 正常培養(yǎng)7d ALP 染色大體照及鏡下（20×）；b 成骨誘導7d ALP 染色大體照及鏡下（20×）；c 正常培養(yǎng)21d 茜素紅染色大體照及鏡下（20×）；d 成骨誘導21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）。

C57-BMSCs成骨誘導7天ALP、21天茜素紅染色注：a正常培養(yǎng)7dALP染色大體照及鏡下（20×）；b成骨誘導7dALP染色大體照及鏡下（20×）；c正常培養(yǎng)21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）；d成骨誘導21d茜素紅染色大體照及鏡下（20×）
【學位授予單位】：佳木斯大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R781.05

【參考文獻】

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1 陳波;俞惠新;譚成;林秀峰;張莉;曹國憲;羅世能;;碘標白藜蘆醇及其小鼠體內分布[J];原子能科學技術;2008年06期

本文編號：2598207