本文關(guān)鍵詞：TLR4在破骨細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其與經(jīng)典Wnt信號(hào)相互作用機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨骼作為人體重要器官發(fā)揮著不可或缺的作用，與此同時(shí)骨疾病也成為人類面臨的重大疾病之一，近年來(lái)細(xì)菌感染導(dǎo)致的炎癥性骨疾病發(fā)生率逐漸增長(zhǎng)，但是其治療仍然是難點(diǎn)�？谇恢谐Ｒ�(jiàn)的炎癥性骨疾病主要有慢性牙周炎和慢性根尖周炎，細(xì)菌是引起慢性根尖周炎和牙周炎的重要物質(zhì)，其中革蘭氏陰性菌占有主導(dǎo)地位，它可以產(chǎn)生脂多糖，脂多糖作為影響牙槽骨骨代謝的重要物質(zhì)，能造成牙槽骨的炎癥與吸收，最終導(dǎo)致牙齒喪失。正常的骨改建主要依賴成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的相互交替作用而完成，炎癥時(shí)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞在這一過(guò)程中的相互協(xié)調(diào)作用會(huì)被擾亂，從而發(fā)生骨的代謝異常。 目前研究報(bào)道TLR4可能參與了LPS引起的炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥因子的表達(dá)主要包括細(xì)胞因子和趨化因子，最終導(dǎo)致炎癥反應(yīng)發(fā)生。經(jīng)典Wnt信號(hào)通路不僅能調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等，而且還在炎癥性骨疾病如慢性牙周炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中發(fā)揮著重要作用。最新研究報(bào)道，TLR4在新生小鼠回腸上皮中可以下調(diào)Wnt信號(hào)，然而關(guān)于TLR4與經(jīng)典Wnt信號(hào)在破骨細(xì)胞中相互作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。既然TLR4與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在骨疾病都起到了如此重要的作用，我們便猜想這兩者在骨代謝過(guò)程中是否也會(huì)相互作用而影響骨組織的吸收和形成呢？ 本研究首先將LPS作為模擬成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的炎癥微環(huán)境的介質(zhì)，然后利用LPS激活破骨細(xì)胞體內(nèi)的TLR4，進(jìn)而采用細(xì)胞免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western blot、細(xì)胞遷移等技術(shù)檢測(cè)TLR4在破骨細(xì)胞中的表達(dá)和作用，同時(shí)也研究了經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在破骨細(xì)胞中的主要作用，以期進(jìn)一步探討TLR4與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在破骨細(xì)胞中的相互作用機(jī)制。 研究?jī)?nèi)容分為三部分： 1、 LPS體外模擬大鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的炎癥微環(huán)境 目的：將LPS作為模擬成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞炎癥微環(huán)境的主要介質(zhì)，檢測(cè)炎癥時(shí)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞主要生物學(xué)特性的改變。 方法：分別配置含不同濃度（0、10ng/ml、100ng/ml、1ug/ml、10ug/ml）LPS的DMEM培養(yǎng)液，分別刺激成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞一定時(shí)間，利用MTT、堿性磷酸酶ALP染色、TRAP染色、ALP含量測(cè)定、RT-PCR等方法分別檢測(cè)LPS刺激細(xì)胞后其主要生物學(xué)特性的改變。 結(jié)果： （1）不同濃度LPS對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化能力均有抑制作用，且都有濃度依賴性。10ug/ml LPS作用于成骨細(xì)胞24h后，其主要成骨相關(guān)標(biāo)志酶ALP、Runx2mRNA表達(dá)水平均較對(duì)照組明顯降低（P0.05）。 （2）不同濃度LPS均可促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖和分化能力，且能增高破骨細(xì)胞破骨相關(guān)標(biāo)志酶TRAP、MMP-9、CathinK mRNA的表達(dá)水平（P0.05）。 結(jié)論：LPS模擬成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞炎癥微環(huán)境時(shí)，可能造成成骨細(xì)胞的活性降低，而破骨細(xì)胞的活性增高。 2、 TLR4在炎性破骨細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng) 目的：檢測(cè)TLR4在破骨細(xì)胞中的表達(dá)變化及炎癥時(shí)對(duì)破骨細(xì)胞遷移率和細(xì)胞內(nèi)破骨相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的作用。 方法：將實(shí)驗(yàn)分為2組：（1）對(duì)照組：正常DMEM培養(yǎng)液（2）含10ug/ml LPS的DMEM培養(yǎng)液，兩組分別刺激細(xì)胞24h，利用PCR、Western、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、細(xì)胞遷移等方法檢測(cè)TLR4在破骨細(xì)胞中的表達(dá)變化及炎癥時(shí)其對(duì)破骨細(xì)胞遷移率和破骨活性相關(guān)酶的作用。 結(jié)果： （1）TLR4在正常破骨細(xì)胞中是可以表達(dá)的，，且較對(duì)照組相比，LPS能激活其mRNA、蛋白水平及熒光強(qiáng)度在破骨細(xì)胞中的表達(dá)（P0.05）。 （2）TLR4被LPS激活后可作用于破骨細(xì)胞而增高細(xì)胞破骨相關(guān)酶的活性及細(xì)胞遷移率（P0.05）。 結(jié)論：破骨細(xì)胞內(nèi)TLR4被LPS激活后可能通過(guò)激活其下游某通路而導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)。 3、經(jīng)典Wnt信號(hào)在炎性破骨細(xì)胞中的主要作用及其與TLR4的相互作用機(jī)制研究 目的：Wnt信號(hào)通路對(duì)炎性破骨細(xì)胞內(nèi)相關(guān)標(biāo)志酶的主要作用及其與TLR4在破骨細(xì)胞中的相互作用進(jìn)行研究。 方法：實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組（正常培養(yǎng)液）、LPS組（10ug/ml）、Wnt3a組（100ng/ml）、DKK1組（200ng/ml）、LPS+DKK1組、LPS+Wnt3a組，分別與破骨細(xì)胞共同培養(yǎng)24h后；利用RT-PCR分別檢測(cè)破骨細(xì)胞中破骨相關(guān)酶酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、組織蛋白酶K(cathin K)、TLR4以及經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中主要信號(hào)分子β-catenin、LRP-6mRNA表達(dá)水平。同時(shí)利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)LPS激活TLR4后細(xì)胞內(nèi)β-catenin熒光強(qiáng)度的變化。 結(jié)果： （1）外源性Wnt3a、DKK1作用于破骨細(xì)胞后，Wnt3a能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)破骨相關(guān)標(biāo)志酶mRNA的表達(dá)水平、DKK1則上調(diào)其mRNA的表達(dá)水平（P0.05）；但兩者對(duì)TLR4mRNA的表達(dá)水平均無(wú)明顯作用（P0.05）。 （2）LPS可激活破骨細(xì)胞中TLR4的表達(dá)，其被激活后使破骨細(xì)胞內(nèi)各破骨相關(guān)酶mRNA的表達(dá)水平上調(diào)（P0.05）；同時(shí)LPS激活TLR4后可下調(diào)Wnt信號(hào)分子β-catenin、LRP-6mRNA的表達(dá)水平和β-catenin的熒光表達(dá)強(qiáng)度（P0.05）。 （3）將Wnt3a、DKK1、LPS+Wnt3a、LPS+DKK1分別作用破骨細(xì)胞24h后，與LPS單獨(dú)刺激相比，LPS聯(lián)合Wnt3a作用后使其對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶表達(dá)的上調(diào)作用明顯降低（P0.05）；相反地，LPS聯(lián)合DKK1作用后也使其對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶表達(dá)的上調(diào)作用進(jìn)一步增強(qiáng)（P0.05）。 結(jié)論：TLR4可能通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)而促進(jìn)破骨細(xì)胞的活性；同樣，經(jīng)典Wnt信號(hào)也可能拮抗LPS參與的炎癥反應(yīng)過(guò)程中TLR4對(duì)破骨細(xì)胞相關(guān)酶的激活作用。
【關(guān)鍵詞】：破骨細(xì)胞 脂多糖 Toll樣受體4 β-catenin 經(jīng)典wnt信號(hào) 基質(zhì)金屬蛋白酶9 酒石酸酸性磷酸酶 組織蛋白酶K
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-24
• 一、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞參與骨改建的研究進(jìn)展16-18
• 1．成骨細(xì)胞在骨改建中的主要作用16
• 2．破骨細(xì)胞在骨改建中的主要作用16-17
• 3．成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞在骨改建中的相互作用17-18
• 二、脂多糖 LPS 參與骨疾病的研究進(jìn)展18-19
• 三、TLR4 參與炎癥性骨疾病的研究進(jìn)展19-21
• 1．TOLL 樣受體參與炎癥的研究進(jìn)展19
• 2．TOLL 樣受體 4（TLR4）參與炎癥的研究進(jìn)展19-21
• 四、經(jīng)典 WNT 信號(hào)通路參與炎癥性骨疾病的研究進(jìn)展21-24
• 1．Wnt 信號(hào)通路在骨改建中的主要作用21-22
• 2. Wnt 信號(hào)通路參與炎癥性骨疾病的研究進(jìn)展22-24
• 研究?jī)?nèi)容24-54
• 實(shí)驗(yàn)一 大鼠成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定24-32
• 1 材料24
• 2 方法24-26
• 3 結(jié)果26-31
• 4 討論31-32
• 實(shí)驗(yàn)二 LPS 體外模擬大鼠成骨、破骨細(xì)胞的炎癥微環(huán)境32-39
• 1 材料32
• 2 方法32-34
• 3 結(jié)果34-38
• 4 討論38-39
• 實(shí)驗(yàn)三 TLR4 在破骨細(xì)胞中的表達(dá)及其生物學(xué)效應(yīng)39-47
• 1 材料39
• 2 方法39-41
• 3 結(jié)果41-45
• 4 討論45-47
• 實(shí)驗(yàn)四 TLR4 及經(jīng)典 WNT 通路在破骨細(xì)胞中的相互作用47-54
• 1 材料47
• 2 方法47-48
• 3 結(jié)果48-52
• 4 討論52-54
• 小結(jié)54-56
• 參考文獻(xiàn)56-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果66-67
• 致謝67

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 付斌;唐國(guó)華;;Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)途徑與骨改建[J];國(guó)際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2010年05期

2 劉文佳;王曉庚;周洪;李昂;;高純度破骨樣細(xì)胞體外培養(yǎng)及功能表達(dá)的研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2008年06期

3 趙玉明;葛立宏;A E Grigoriadis;;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β對(duì)體外破骨細(xì)胞分化的影響[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年01期

4 于世鳳;骨吸收與骨形成[J];現(xiàn)代康復(fù);2001年04期

5 楊文東;李志新;高學(xué)軍;;IL-1β mRNA和TNFα mRNA在慢性根尖周病損組織中的表達(dá)[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2007年04期

  本文關(guān)鍵詞：TLR4在破骨細(xì)胞中的生物學(xué)作用及其與經(jīng)典Wnt信號(hào)相互作用機(jī)制的初步研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：255684