【摘要】：牙周炎是一種發(fā)病普遍的口腔疾病,在牙周炎中,牙周支持組織既表現(xiàn)出慢性炎癥性改變的基本規(guī)律如血管增加充血等,又會引發(fā)牙槽骨的吸收從而導致組織的進展性破壞及修復困難;當大量牙周支持組織喪失后將導致牙齒缺失,危害人類口腔健康,目前對于牙周病組織的再生性修復還存在一定困難。對牙周炎病理變化的研究可以讓人們更好的了解該疾病的發(fā)生發(fā)展,為治療牙周炎提供新思路,因此具有重要意義。間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)具有重要細胞生物學作用,包括多向分化以及旁分泌調(diào)節(jié)鄰近細胞功能等等。在生理狀態(tài)下,牙周組織的成骨機制與成血管機制有著密切的聯(lián)系,而在細胞層面上,MSCs與內(nèi)皮細胞(Endothelial cells,ECs)也有著密切的聯(lián)系。有研究表明在有ECs存在的情況下,MSCs自身的功能性狀也會發(fā)生改變。牙周膜干細胞(Periodontal ligament stem cells,PDLSCs)作為一種存在于牙周支持組織內(nèi)的MSCs,具有和一般MSCs類似的性質(zhì)。PDLSCs也可能通過旁分泌對其周圍的細胞和環(huán)境產(chǎn)生影響。但是有研究表明在炎癥環(huán)境下,PDLSCs自身的生物學功能發(fā)生了改變,炎性環(huán)境會導致其成骨分化的能力大大降低。那么牙周炎癥時,PDLSCs與其周圍細胞如ECs及微環(huán)境間的交互作用也可能發(fā)生了改變,從而影響了牙周炎的病理表現(xiàn)。炎性PDLSCs與ECs的交互作用可能會改變炎性PDLSCs的成骨功能及促血管生成功能,而在這一方面尚沒有明確的研究報道。牙周炎癥時,牙周組織內(nèi)的成骨效應降低,而血管系統(tǒng)也發(fā)生了改變。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)與血管的發(fā)生密切相關,在牙周組織如牙齦及齦溝液等都可以檢測到高表達的VEGF,炎性牙周組織中增生的血管以及增高的VEGF可以使更多的炎性細胞及因子滲透入炎癥局部,從而增加或維持牙周炎的病理狀況。又有研究顯示在炎性環(huán)境的作用下,牙齦成纖維細胞的EKR磷酸化水平會增高且VEGF的表達也增高,因此我們推測,炎性環(huán)境或許也通過ERK使PDLSCs旁分泌VEGF的性能發(fā)生改變,從而改變了牙周組織中的血管形成,引起了微環(huán)境變化。另外,不少研究表明ERK通路與自噬之間存在著調(diào)控關系,而自噬對于MSCs的細胞生物學功能等多個方面均具有重要影響。若PDLSCs可以通過ERK通路調(diào)控ECs血管化能力,那么自噬是否也參與到了其中?目前,對于炎性PDLSCs如何通過旁分泌途徑與其微環(huán)境相互影響的作用機制還少有研究。本課題著眼于此,嘗試探討旁分泌機制下炎性微環(huán)境中PDLSCs的成骨及促ECs成血管能力的變化,主要分為以下三個部分進行:第一部分炎性環(huán)境下ECs對PDLSCs成骨分化能力的影響【實驗目的】探討炎癥狀態(tài)PDLSCs在ECs旁分泌的影響下成骨分化能力水平的變化。【實驗方法】獲取和培養(yǎng)正常及炎癥來源的PDLSCs,并用炎性因子TNF-α為PDLSCs制造炎性環(huán)境,然后用ECs條件培養(yǎng)液(ECs-conditioned medium,ECCM)培養(yǎng)以及與ECs間接共培養(yǎng)的方法處理正常及炎癥狀態(tài)下的PDLSCs,采用Western blot及qRT-PCR觀察干預后PDLSCs的成骨分化能力指標ALP、OCN等的變化。為了排除細胞凋亡水平對于其成骨分化能力的影響,實驗將正常與炎癥的PDLSCs與ECs共培養(yǎng)后,用凋亡染色試劑于流式細胞儀上檢測PDLSCs的凋亡水平是否有變化。【實驗結果】在ECCM的影響下,正常及炎癥PDLSCs的成骨分化能力相關指標ALP和OCN等沒有明顯變化;在與ECs間接共培養(yǎng)的條件下,正常及炎癥PDLSCs的各項成骨分化能力相關指標均有所下降;在與ECs間接共培養(yǎng)的條件下,炎癥PDLSCs的凋亡水平有所下降�！窘Y論】在ECs的旁分泌機制下,正常與炎癥環(huán)境下的PDLSCs成骨分化均有所下降,這種現(xiàn)象很可能與ECs和PDLSCs的交互作用有關。且ECs引起的PDLSCs成骨分化水平下降并非由于PDLSCs的細胞狀態(tài)下降引起,相反,ECs降低了炎性狀態(tài)下PDLSCs的凋亡水平。第二部分炎性環(huán)境對PDLSCs促ECs血管形成能力的影響【實驗目的】探討炎性PDLSCs促ECs血管形成能力的變化及VEGF在其中的作用;探討ERK在PDLSCs促ECs血管形成中的作用。【實驗方法】通過免疫組化、Western blot及qRT-PCR的方法比較炎癥與正常牙周膜組織中VEGF的表達量,而后通過qRT-PCR和ELISA檢測炎性因子(TNF-α和IL-1β)處理PDLSCs后的VEGF表達量變化以驗證PDLSCs在炎性環(huán)境下是否分泌VEGF增加。為了直接檢測炎性PDLSCs影響ECs血管形成的作用,將炎性PDLSCs與正�；蜓装Y狀態(tài)ECs間接共培養(yǎng)后用Matrigel基質(zhì)膠管腔形成試驗和qRT-PCR檢測ECs血管形成能力的變化。利用VEGF中和抗體試驗中和掉PDLSCs分泌的VEGF后,基質(zhì)膠管腔形成試驗和qRT-PCR檢測ECs血管形成的變化以確定VEGF在PDLSCs調(diào)控ECs血管化中的作用。研究ERK在PDLSCs促ECs血管形成中的作用時,首先進行Western blot檢測以觀察炎性環(huán)境對于PDLSCs中ERK通路的影響,隨后用U0126阻斷正常或炎癥狀態(tài)PDLSCs的ERK通路后,qRT-PCR和ELISA檢測其VEGF的分泌表達變化,以及基質(zhì)膠管腔形成試驗和qRT-PCR檢測與其共培養(yǎng)的ECs血管形成能力變化。【實驗結果】炎癥牙周膜組織中的VEGF表達較正常組織高;炎性環(huán)境下PDLSCs分泌VEGF增加;炎性PDLSCs較炎性環(huán)境自身更能促進ECs形成血管,且其調(diào)控通過VEGF旁分泌機制進行;炎性PDLSCs促ECs血管形成能力隨著炎性因子作用時間的延長先升高后有所下降;炎性環(huán)境提高了PDLSCs中ERK的磷酸化水平,從而促進VEGF的分泌;ERK通路參與調(diào)控了炎性PDLSCs促ECs血管形成的過程。【結論】雖然炎性環(huán)境自身對ECs的成血管能力有影響,但炎性PDLSCs對于促ECs血管形成具有更顯著的作用。炎性環(huán)境可以激活提高PDLSCs中的ERK通路,而ERK通路調(diào)控了炎性環(huán)境下PDLSCs中VEGF的表達和分泌。ERK激活水平增高時,VEGF的分泌表達同時也增高,使ECs的血管化程度增加。因此,ERK通路調(diào)控了炎性PDLSCs促ECs血管化的能力。第三部分自噬對于PDLSCs促ECs血管形成能力的影響【實驗目的】1、探索炎性環(huán)境下PDLSCs自噬水平的變化;2、探索在炎癥環(huán)境下PDLSCs中ERK與自噬的關系;3、探索自噬在炎性PDLSCs促ECs血管形成中的作用�！緦嶒灧椒ā坑形墨I報道ERK可以調(diào)控自噬進而調(diào)控MSCs各項功能,于是我們首先檢測了炎性環(huán)境下PDLSCs的自噬水平變化。從上一部分可以得出炎性PDLSCs促ECs血管形成能力隨著炎性因子作用時間的延長先升高后下降,因此我們用Western blot和qRT-PCR的方法檢測相同時間點(2天和7天)炎性因子刺激下PDLSCs中LC3及其他自噬相關蛋白的變化。其次,用炎性因子和U0126分別提高和阻斷PDLSCs中的ERK通路,然后用相同方法檢測PDLSCs中LC3及其他自噬相關蛋白的表達情況以觀察ERK通路對于PDLSCs自噬水平的影響。為了探索自噬在炎性PDLSCs促ECs血管形成中的作用,我們對炎性因子刺激7天的PDLSCs施加雷帕霉素(Rapamycin)以提升其自噬水平,然后將其與ECs共培養(yǎng),Matrigel基質(zhì)膠管腔形成試驗和qRT-PCR檢測ECs血管形成能力的變化。最后用Si-Beclin-1轉(zhuǎn)染的辦法降低炎性因子刺激2天后的PDLSCs的自噬水平,再利用相同方法檢測其促ECs血管形成的能力�！緦嶒灲Y果】炎性環(huán)境下的PDLSCs自噬水平先升高后有所下降,與其促ECs血管形成能力趨勢相一致;ERK可以正向調(diào)控PDLSCs的自噬水平,表現(xiàn)為炎性因子作用下ERK水平增高,自噬相關蛋白LC3 II和Beclin-1等均隨之升高,而在阻斷ERK通路后,炎性PDLSCs中相應的自噬相關蛋白表達均下降;提高炎癥因子刺激7天的PDLSCs自噬水平后,其促ECs血管形成能力增加;降低炎性因子刺激2天的PDLSCs自噬水平,其促ECs血管形成能力也相應減弱�！窘Y論】在炎性條件下,PDLSCs細胞的自噬水平先增高后有所降低。ERK參與調(diào)控了PDLSCs的自噬水平,表現(xiàn)為ERK通路激活水平高時,PDLSCs的自噬水平也提高,而在阻斷ERK通路時,自噬水平相應降低。自噬也參與調(diào)控了炎性PDLSCs促ECs血管形成的過程,自噬升高時,炎性PDLSCs促ECs血管形成能力高,而在自噬降低時,ECs血管形成也相應下降。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R781.4
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本文編號：2491598