【摘要】：研究背景 慢性牙周炎是由菌斑微生物引起的慢性非特異性炎癥,以造成牙周組織破壞、牙槽骨吸收和病理性牙周袋為特征,引起牙周支持組織的破壞,導致牙齒松動脫落,是造成成年人后天性牙齒缺失的主要原因。學者們按照循證醫(yī)學的原則進行了大規(guī)模的流行病學觀察或病例對照研究,并采用科學的統(tǒng)計分析方法,發(fā)現(xiàn)牙周感染可能是心腦血管疾病、糖尿病、妊娠并發(fā)癥、呼吸道感染、類風濕性關節(jié)炎等疾病的獨立危險因素,或兩種疾病具有共同危險因素。 慢性牙周炎是發(fā)生在口腔局部的炎癥性疾病,糜爛的牙周袋上皮為細菌、細菌產(chǎn)物和炎癥介質的慢性來源。這么大面積的隱匿病灶如果長期存在不加以控制,不僅造成口腔局部嚴重的炎癥,破壞牙周支持組織,細菌及其有毒產(chǎn)物、炎癥介質還可以通過血液進入循環(huán)系統(tǒng),感染其他器官；此外,還會啟動機體的免疫應答,使宿主細胞釋放細胞因子和炎癥介質,導致機體處于炎癥狀態(tài)。 糖尿病被世界衛(wèi)生組織定為目前嚴重影響全人類健康的三大疾病之一,在全球的發(fā)病情況不容樂觀。Ⅱ型糖尿病也稱非胰島素依賴型糖尿病,源于組織對胰島素的敏感性降低,即胰島素抵抗現(xiàn)象和胰島素產(chǎn)生障礙,是胰島素分子或其受體水平的缺陷狀態(tài)。牙周炎作為糖尿病的第六大并發(fā)癥,它與糖尿病之間的關系一直是學術界研究的重點。目前,糖尿病與牙周炎二者之間的雙向關系已經(jīng)被證實。糖尿病是牙周炎的獨立危險因素,慢性牙周炎不利于糖尿病患者的血糖控制。 II型糖尿病胰島病變的特點之一是p細胞數(shù)量不足,凋亡增加。發(fā)生II型糖尿病時,胰島素敏感組織產(chǎn)生的炎癥因子導致循環(huán)系統(tǒng)中IL-6和TNF-a水平升高。多種細胞因子都對p細胞凋亡有誘導作用。促炎癥因子(IL-1, TNFα, IFNγ)可以通過一氧化氮使鈣離子在內質網(wǎng)集聚,破壞鈣離子依賴蛋白,使內質網(wǎng)壓力增加,誘導細胞凋亡。除此之外,TNF-a可能直接作用于胰島細胞凋亡。IL-1β會導致Fas表達的增加,促進p細胞凋亡；IL-1β還能促進蛋白激酶C的活化,通過凋亡機制引起胰島p細胞的破壞。 目前國內外尚未見到關于慢性牙周炎對T2DM的胰腺影響的研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),在肥胖大鼠模型中,牙周炎可以促進胰島素抵抗的發(fā)展,促進胰島結構紊亂,并與胰島素抵抗指數(shù)呈正相關,提示在低度慢性炎癥機體下,牙周炎可能通過促進胰島細胞的破壞而影響其功能。因此,本研究在前期研究基礎上,擬通過建立II型糖尿病OLETF大鼠合并牙周炎的動物模型,研究牙周炎對糖尿病機體胰島細胞凋亡相關機制的影響,初步探討牙周炎對糖尿病大鼠胰腺病變的影響及可能機制。 第一章牙周炎復合糖尿病大鼠模型的建立 目的 利用自發(fā)II型糖尿病的OLETF大鼠,通過絲線結扎聯(lián)合涂菌法,建立II型糖尿病復合牙周炎模型,為進一步研究牙周炎對II型糖尿病大鼠胰島組織形態(tài)和凋亡相關蛋白表達奠定基礎。 方法 (1)自發(fā)Ⅱ型糖尿病OLETF大鼠30只,4周齡,雄性;其同種系同周齡糖耐量正常對照LETO大鼠20只。OLETF大鼠和LETO大鼠實行牙周炎干預前分別稱為O組和L組。每四周行一次口服糖耐量檢測(OGTT),36周齡時,將到達糖耐量受損期(IGT期)的26只OLETF大鼠,隨機分為兩組,一組行牙周炎造模,稱為復合組(O CP(+)組),另一組為糖尿病組(O CP(-)組)；LETO大鼠也隨機分為兩組,一組行牙周炎造模即牙周炎組(L CP(+)組),另一組為正常組(L CP(-)組)。 (2)采取絲線結扎和涂菌法建立實驗性牙周炎模型。將3.0絲線分別結扎于左、右上頜第一磨牙(molar1, M1)及第二磨牙(molar2, M2)牙頸部并盡量將結扎好的絲線壓入深牙周袋內,以完全沒入牙齦為準,將濃度為109CFU/ml的4種標準菌(牙齦卟啉單胞菌、伴放線嗜血桿菌、中間普氏菌、具核梭桿菌)混合懸液接種于齦溝內。 (3)56周齡時,處死所有實驗大鼠,采集血清檢測大鼠血清胰島素水平；收集組織樣本,頜骨樣本進行Micro-CT掃描,EDTA脫鈣后常規(guī)脫水包埋,切片行HE染色,觀察牙周炎癥狀態(tài)。 結果 (1)比較四組大鼠HOMA-IR值,O CP(+)組胰島素抵抗指數(shù)顯著高于O CP(-)組(t=-0.6058,p=0.000), LCP(-)組和L CP(+)組之間沒有顯著差異(t=1.721,P=0.107)。 (2)比較四組大鼠牙槽骨吸收體積,O CP(+)組與L CP(+)組牙槽骨骨喪失量明顯分別大于O CP(-)組和L CP(-)組,差別具有統(tǒng)計學意義(t=4.296,P=0.013；t=5.963,P=0.004)。 (3)觀察四組大鼠牙周組織切片HE染色,L CP(-)組及O CP(-)組大鼠牙齦結合上皮附著緊密,牙齦和牙周膜膠原纖維排列有序,上皮下固有層極少量炎細胞浸潤。L CP(+)組和O CP(+)組大鼠牙齦上皮釘突變長,牙齦牙周膜膠原纖維排列紊亂、破壞,上皮下固由層大量炎細胞浸潤,O CP(+)組炎癥更重,上皮釘突甚至呈條索狀。 結論 (1)本實驗利用OLETF糖尿病大鼠模型,采用絲線結扎聯(lián)合涂菌法進行牙周炎造模,成功建立了牙周炎復合II型糖尿病動物模型。 (2)本實驗結果提示單純牙周炎并不會引起大鼠胰島素抵抗,但是在T2DM狀態(tài)下,牙周炎通過加重機體的炎癥水平,加重胰島素抵抗程度。 第二章牙周炎對糖尿病大鼠胰腺組織形態(tài)的影響 目的 通過牙周炎復合糖尿病模型大鼠胰腺組織形態(tài)及相關代謝的觀察,初步探索牙周炎對糖尿病大鼠的組織病理學影響機制。 方法 胰腺組織固定后,常規(guī)脫水包埋,制成石蠟切片,分別行HE染色、MASSON染色和胰島素抗體免疫組化染色,在光學顯微鏡下觀察胰腺尤其是胰島的組織形態(tài)。 結果 (1)HE染色結果顯示, LCP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島細胞成團分布于外分泌腺中,胰島細胞胞核藍染,胞質淡染,胰島與外分泌腺邊界清晰。相對于正常組大鼠,O CP(-)組大鼠胰島組織結構出現(xiàn)異常,胰島細胞排列紊亂,與外分泌腺邊界不清。O CP(+)組大鼠胰島形態(tài)紊亂更重,有外分泌腺長入胰島,胰島被增生纖維分割,外分泌腺中出現(xiàn)脂肪異位沉積。 (2) MASSON染色結果顯示,L CP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島內幾乎沒有纖維組織,胰島外圍有菲薄的結締組織被膜包繞,與外分泌腺邊界清晰。O CP(-)組大鼠胰島內纖維組織增多呈淡藍色,在外分泌腺也觀察到纖維成分增多。OCP(+)組大鼠胰島結構紊亂,大量纖維組織機化替代正常胰島細胞,脂肪異位沉積。 (3)胰島素抗體免疫組化結果顯示,L CP(-)組和L CP(+)組大鼠胰島中大部分細胞為p細胞,而且分布在中央呈陽性表達強,形狀規(guī)則。0CP(-)組大鼠p細胞細胞分布不規(guī)則,有彌散趨勢,陽性表達減弱。O CP(+)組大鼠胰島p細胞數(shù)量明顯減少,胰島內出現(xiàn)纖維分隔。 結論 本實驗觀察結果提示在健康機體中,單純的慢性牙周炎并不會引起大鼠胰島組織形態(tài)的改變；但糖尿病機體內,牙周炎可能通過加重胰腺的病理改變,破壞胰島的正常分泌功能,從而加重糖尿病大鼠的代謝機能異常。 第三章牙周炎對糖尿病大鼠胰島細胞凋亡相關蛋白表達的影響 目的 通過檢測胰島細胞中凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達,探索牙周炎對糖尿病大鼠胰島病變影響的可能凋亡機制。方法 大鼠胰腺行凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3免疫組化染色,進行半定量分析,比較四組大鼠胰島中凋亡相關蛋白表達量。結果 (1)Bax蛋白在O CP(+)組的表達比O CP(-)組強,并且差異具有統(tǒng)計學意義(t=7.123,p=0.000).L CP(-)組和L CP(+)胰島中Bax蛋白表達很弱,兩組間沒有顯著差異(t=-1.022,P=0.324)。 (2)Bcl-2蛋白在L CP(+)組和L CP(-)組表達較其余兩組強,但兩組間表達沒有統(tǒng)計學差異(t=1.814,P=0.091),O CP(+)組蛋白表達最弱,與O CP(-)組相比,差異具有統(tǒng)計學意義(t=-2,565,P=0.022)。 (3) Caspase-3蛋白在O CP(+)組表達強于O CP(-)組,兩組之間差異有統(tǒng)計學意義(t=7.134,P=0.000)；在L CP(+)組和L CP(-)組表達都很弱,且兩組間表達沒有顯著差異(t=-0.190,P=0.852)。 結論 本實驗結果提示糖尿病狀態(tài)下,慢性牙周炎可能通過調控相關凋亡蛋白的表達,影響促進/抑制細胞凋亡的平衡,從而破壞機體的胰島相關功能,提示在糖尿病合并牙周炎狀態(tài)下,胰島細胞向促凋亡方向發(fā)展。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R781.4;R587.1

【參考文獻】

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本文編號：2459114