發(fā)布時間：2019-03-24 16:21

【摘要】：背景:既往正畸治療主要以青少年為主,近年來,隨著社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展和人民生活水平的提高,公眾對口腔健康及面部審美的要求日益增強,臨床上成人正畸矯治的比例逐年增加。但是與青少年相比,成人正畸治療時間長,且治療效果也不如青少年完善。牙周組織的改建是影響正畸療效與療程快慢的關(guān)鍵問題,牙周膜連接牙齒與牙槽骨,在牙周組織改建的過程中起到橋梁作用。牙周膜細胞是正畸矯治力的直接效應細胞,在牙周組織改建過程中發(fā)揮重要作用。當矯治力傳遞到牙周膜上時,牙周膜中的前體細胞或牙周膜干細胞在張力側(cè)分化為成骨細胞,引起骨沉積;在壓力側(cè)分化為破骨細胞,引起骨吸收。牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSC)是來源于牙周膜組織的成體干細胞,可來源于牙根部或牙槽窩內(nèi)的牙周膜組織,與牙周組織關(guān)系密切。2004年,Seo等利用單細胞克隆技術(shù)首次證實了牙周膜干細胞(PDLSC)的存在,研究證實其具有良好的增殖能力、自我更新能力和多向分化能力,在特定的誘導條件下可向不同細胞進行分化,其不僅在牙周病的治療、種植體周圍軟硬組織缺損的修復過程中發(fā)揮重要作用,同時參與正畸牙齒移動中的骨改建,在正畸牙齒移動過程中發(fā)揮重要作用。機械力在正畸的牙槽骨改建過程中發(fā)揮重要作用,然而年齡因素也是影響正畸過程中牙周組織改建的重要因素。隨著年齡的增長,干細胞的功能受到一定影響,其平衡遭到破壞。機體增齡的過程中,間充質(zhì)干細胞的自我調(diào)節(jié)機制發(fā)生改變,從而使其某些生物學性狀不再穩(wěn)定,主要表現(xiàn)為自身抵抗力的降低及其對外界環(huán)境刺激的反應能力的降低,從而誘發(fā)疾病的易感性,最終引起死亡,因而增齡可能會引起機體內(nèi)干細胞生物學特性發(fā)生變化,從而影響最終的正畸治療效果,但其影響機制目前尚不明確。Wnt信號通路廣泛存在于生物體中,在胚胎和多種器官的發(fā)育過程中發(fā)揮重要的信號轉(zhuǎn)導作用,調(diào)控了多種生命過程,如細胞的增殖、分化、凋亡、免疫、應激等。研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號通路在牙周膜的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,同時可調(diào)控PDLSC的增殖與分化。近年來的研究提示,Wnt信號通路與干細胞的增齡變化有密切關(guān)系,有學者發(fā)現(xiàn)Wnt/ β -catenin信號通路對骨髓間充質(zhì)干細胞的衰老發(fā)揮重要調(diào)控作用,也有研究表明Wnt/β -catenin信號通路可以通過促進細胞產(chǎn)生ROS進而誘導間充質(zhì)干細胞的衰老,然而目前關(guān)于PDLSC增齡的調(diào)控機制目前尚無相關(guān)報道。目的:獲取不同年齡階段健康離體牙,分離培養(yǎng)PDLSC,觀察增齡因素對PDLSC的生物學特性的影響,并探索Wnt信號通路與增齡過程中PDLSC成骨分化能力的關(guān)系。方法:第一部分:分別獲取不同年齡組患者的健康離體牙(3組病例資料情況:A組,年齡18-20歲,男4例,女4例:B組,年齡30-35歲,男4例,女4例:C組,年齡45以上歲,男4例,女4例),分離培養(yǎng)獲得牙周膜干細胞(PDLSC),對其生物學特性進行對比分析。通過MTT檢測三組PDLSC增殖能力的差異;檢測三組PDLSC的克隆形成能力;對其進行成骨、成脂誘導分化實驗,并用茜素紅染色評價其成骨分化能力,油紅O染色評價其成脂分化能力;通過流式細胞儀檢測細胞周期和其凋亡,并通過SA-β-gal染色分析細胞衰老程度差異。第二部分:牙周膜干細胞具有多向分化能力,為了明確增齡因素對PDLSC成骨分化能力的影響,對三個實驗組的PDLSC均進行成骨誘導,成骨誘導7d后對其進行ALP染色,同時提取RNA和蛋白。采用實時定量PCR檢測其成骨關(guān)鍵基因ALP、Runx-2和col-1的表達,并用Western blot定量比較成骨誘導前后成骨相關(guān)蛋白ALP、OCN的表達。第三部分:為了檢測增齡條件下矛周膜干細胞與Wnt信號通路的關(guān)系,對三個實驗組的PDLSC均進行成骨誘導,成骨誘導7d后提取RNA和蛋白。采用實時定量PCR檢測其Wnt相關(guān)基因Wnt/ -catenin、P38和NLK的表達,并用Western blot定量比較成骨誘導前后Wnt關(guān)鍵蛋白Wnt/β -catenin、P38和NLK的表達。結(jié)果:第一部分:增齡因素影響下PDLSC生物學特性的變化1、不同年齡階段的供體中都能分離出PDLSC:2、三個實驗組PDLSC的克隆形成率從年輕組到增齡組有所下降,分別為36.67%,26.67%, 9.33%,有統(tǒng)計學差異;3、MTT增殖檢測顯示三個實驗組均有較強的增殖能力,從第五天開始,三個實驗組的增殖能力出現(xiàn)差異,差異有統(tǒng)計學意義:PDLSC細胞周期檢測S+G2/M期的比例從年輕組到增齡組有所下降,分別為38.73%,29.88%,18.25%;4、茜素紅染色顯示三個實驗組PDLSC成骨誘導21d后均可見礦化結(jié)節(jié)形成,但礦化結(jié)節(jié)大小和數(shù)量從年輕組(A組)到增齡組(C組)逐漸減少,油紅O染色顯示三個實驗組PDLSC成脂誘導14d后均可見脂滴形成,但脂滴數(shù)量與從A組到C組增加;5、從年輕組到增齡組,三個實驗組PDLSC凋亡早期與晚期的比例有所上升,分別為1.57%, 4.56%, 5.84%;6、SA-β-gal染色顯示,從年輕組到增齡組陽性染色細胞數(shù)目有所增加,其染色面積分別為4.14%,16.39%,50.38%,有統(tǒng)計學差異。第二部分:增齡因素對PDLSC成骨分化能力的影響1、三個實驗組的PDLSC成骨誘導后ALP染色均可染色,從年輕組到增齡組其染色面積減少。2、實時定量PCR檢測提示成骨誘導后成骨關(guān)鍵基因ALP、col-1、Runx-2表達從年輕組到增齡組有所下降。3、Western blot進一步證實成骨誘導后,成骨關(guān)鍵蛋白ALP、OCN表達均較對照組明顯升高,但成骨誘導后從年輕組到增齡組其表達的灰度值下降。第三部分:增齡因素影響下Wnt通路調(diào)控PDLSC的成骨分化1、實時定量PCR檢測提示,三個實驗組經(jīng)典Wnt/β -catenin的表達水平從年輕組到增齡組有所上升,成骨誘導后其表達均增強,從年輕組到增齡組仍呈上升趨勢。2、實時定量PCR檢測提示三個實驗組NLK表達水平從年輕組到增齡組有所上升,成骨誘導后其表達均下降。3、實時定量PCR檢測提示P38 Mark水平從年輕組到增齡組有所下降,成骨誘導后其表達均下降。4、Western進一步證實成骨誘導后經(jīng)典Wnt/ β -catenin表達水平從年輕組到增齡組有所上升,成骨誘導后其表達均增強,從年輕組到增齡組仍呈上升趨勢。結(jié)論:1、隨著年齡的增長,PDLSC的增殖能力下降、成脂分化能力增強,凋亡水平升高。2、隨著年齡的增長,PDLSC的成骨分化能力下降。3、隨著年齡的增長,經(jīng)典Wnt信號通路的核心蛋白β-catenin表達增強
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【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R783.5

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本文編號：2446487