【摘要】：干細(xì)胞是一類可以自我更新、可以分化成特定類型的功能細(xì)胞。根據(jù)來(lái)源的不同，干細(xì)胞一般分為胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells）和成體干細(xì)胞（adult stemcells）。胚胎干細(xì)胞可以分化為體內(nèi)所有類型的細(xì)胞，而成體干細(xì)胞可以分化為相應(yīng)器官的所有類型的細(xì)胞（如造血干細(xì)胞可以分化為造血系統(tǒng)所有類型的細(xì)胞）。再生醫(yī)學(xué)就是將干細(xì)胞先分化為特定類型的功能細(xì)胞（如心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等），再將這些細(xì)胞移植到病人體內(nèi)，替代損傷的組織，這種細(xì)胞治療不是簡(jiǎn)單的用健康的細(xì)胞替代損傷的組織，而是使細(xì)胞移植后繼續(xù)增殖分化行使功能從根本上治愈疾病。干細(xì)胞研究和再生醫(yī)學(xué)給治療退行性疾病、不可逆性疾病帶來(lái)全新的手段和希望，引起各國(guó)政府的重視和大眾的關(guān)注，在全球掀起干細(xì)胞研究及應(yīng)用的熱潮，干細(xì)胞治療必將成為未來(lái)醫(yī)學(xué)的主流。 近年來(lái)，從兒童和成人的牙齒相關(guān)組織如牙齦、牙周膜、齦乳頭、濾泡和牙髓中均發(fā)現(xiàn)了干細(xì)胞[1-6]。這些干細(xì)胞來(lái)源于外胚間充質(zhì)，與骨髓間充質(zhì)來(lái)源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有類似的生物學(xué)特性如表達(dá)Stro-1、CD146、CD105等表面標(biāo)記，能夠分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等特性。不僅如此，牙源性干細(xì)胞來(lái)源廣泛，可以從醫(yī)療廢棄物中獲得，如阻生牙、正畸需要拔除的牙等，因此它們具有更為廣闊的應(yīng)用前景[7]。 牙髓干細(xì)胞（Dental pulp stem cells，DPSCs）和牙周膜干細(xì)胞（Periodontalligament stem cells，PDLSCs）均源于外胚間充質(zhì)，由神經(jīng)脊細(xì)胞發(fā)育而來(lái)[8]。是研究較早、研究較多的兩種牙源性干細(xì)胞，不僅體外可以被誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、神經(jīng)源性細(xì)胞等[9]，在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，這些分化潛能也可以得到不同程度的表達(dá)[10,11]。值得注意的是將DPSCs和PDLSCs分別與羥磷灰石-磷酸三鈣復(fù)合植入裸鼠體內(nèi)后，分別形成了牙髓-牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu)[3]和類牙周膜樣組織[4]。許多大動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明DPSCs和PDLSCs是再生牙髓組織和牙周組織最有前景的細(xì)胞，并且已有將牙髓干細(xì)胞[12]和牙周膜干細(xì)胞[13]運(yùn)用于臨床治療的報(bào)道，但其長(zhǎng)期療效還有待進(jìn)一步研究。 值得思考的是，實(shí)驗(yàn)證明將牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞移植入體內(nèi)后細(xì)胞依然長(zhǎng)期存在自我更新和多向分化的潛能[14,15]。例如，牙髓干細(xì)胞在一定條件下可被誘導(dǎo)生成類間充質(zhì)樣細(xì)胞[16]，將誘導(dǎo)后的細(xì)胞植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)可以分化生成類牙髓樣組織結(jié)構(gòu)，證實(shí)誘導(dǎo)后細(xì)胞依然具有分化再生潛能。還有學(xué)者將羊的牙周膜干細(xì)胞在移植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，8周后，移植細(xì)胞依然存在活性；雖然與原牙周膜干細(xì)胞相比移植后的細(xì)胞的自我增殖和多向分化能力有所降低，但其依然可以在體內(nèi)誘導(dǎo)分化形成纖維樣結(jié)構(gòu)和血管樣結(jié)構(gòu)[14]。盡管已有實(shí)驗(yàn)在一定程度上表明牙源性干細(xì)胞在體內(nèi)再生時(shí)可以保持一定的的穩(wěn)定性，但是目前沒有明確的實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞體內(nèi)再生時(shí)干性的保持能力，也沒有研究評(píng)價(jià)過(guò)兩種干細(xì)胞再生前后所具有的生物學(xué)特性發(fā)生的變化。本研究中，我們通過(guò)牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞的異位再生實(shí)驗(yàn)，成功獲取了具有代表性的再生后牙髓樣細(xì)胞（Re-isolated cells from regenerated dental pulp-like tissues，re-DPCs）和再生后牙周膜樣細(xì)胞（Re-isolated cells from regenerated periodontal ligament-like tissues，re-PDLCs），從細(xì)胞水平和分子水平評(píng)價(jià)DPSCs與re-DPCs，PDLSCs與re-PDLCs的細(xì)胞生物學(xué)特性的差異以及干性保持的穩(wěn)定性，結(jié)合已經(jīng)發(fā)表的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步探索干細(xì)胞應(yīng)用于臨床再生治療的可行性。 目的： 利用DPSCs和PDLSCs進(jìn)行異位牙髓牙周組織再生，鑒定再分離的細(xì)胞是否仍然具有自我更新及多向分化潛能等干細(xì)胞的特性，并比較再生后組織中細(xì)胞與DPSCs、PDLSCs生物學(xué)特性的差異，從而判定DPSCs和PDLSCs在再生過(guò)程中能否保持干細(xì)胞穩(wěn)定性，為干細(xì)胞的的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用提供依據(jù)。 方法： 1. DPSCs和PDLSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用組織塊培養(yǎng)法分別培養(yǎng)牙髓細(xì)胞和牙周膜細(xì)胞；通過(guò)有限稀釋法分離、純化得到牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后兩種細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記物。 2. DPSCs和PDLSCs牙本質(zhì)復(fù)合物的制備、異位移植及再生后組織免疫原性鑒定：誘導(dǎo)DPSCs和PDLSCs形成細(xì)胞膜片，，分別與預(yù)處理過(guò)的牙本質(zhì)管/牙本質(zhì)柱復(fù)合成DPSCs牙本質(zhì)管復(fù)合體/PDLSCs牙本質(zhì)柱復(fù)合體，植入免疫缺陷小鼠背部皮下，60天后取材，從再生組織中分離培養(yǎng)細(xì)胞，分離培養(yǎng)出的細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)，鑒定其來(lái)源；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后兩種細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記物。 3. DPSCs和PDLSCs再生前后生物學(xué)性能比較：通過(guò)噻唑藍(lán)比色法、成纖維細(xì)胞集落形成單位檢測(cè)DPSCs和re-DPCs以及PDLSCs和re-PDLCs的自我更新能力；成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、對(duì)比分析牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞的多向分化潛能。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本實(shí)驗(yàn)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式統(tǒng)計(jì)結(jié)果。使用t檢驗(yàn)對(duì)兩組間的差異進(jìn)行比較，使用單因素方差分析分析多組之間的差異，取α=0.05。所有的數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 1.成功分離培養(yǎng)DPSCs和PDLSCs，顯微鏡下觀察兩種細(xì)胞均呈梭形，集落樣生長(zhǎng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)記物STRO-1、CD146、CD29、CD90和CD105，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物CD34和CD45。 2.分離、培養(yǎng)所得再生組織細(xì)胞，免疫熒光檢測(cè)人細(xì)胞膜表面線粒體抗體，證明實(shí)驗(yàn)所得再生組織細(xì)胞為植入的人來(lái)源的細(xì)胞；波形蛋白抗體染色，證明所得細(xì)胞為間充質(zhì)干細(xì)胞分化而來(lái)。 純化所得再生組織細(xì)胞，命名為：再生后牙髓樣細(xì)胞（re-DPCs）和再生后牙周膜樣細(xì)胞（re-PDLCs）；流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離純化后的re-DPCs陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記： STRO-1（4.0%）、CD146（19.7%）、CD105（78.5%）、CD29（85.3%）、CD90（99.7%）；陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34（2.0%）和CD45（1.6%）；以上結(jié)果與間充質(zhì)來(lái)源的干細(xì)胞所具有的特征相一致；re-PDLCs中只有CD90（52.3%）呈陽(yáng)性表達(dá)，而陰性表達(dá)STRO-1（2.7%）、CD146（4.6%）、CD105（11.8%）、CD29（17.4%）；陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34（1.9%）和CD45（0.8%）。再生后牙髓樣細(xì)胞和再生后牙周膜樣細(xì)胞的干細(xì)胞表面標(biāo)記表達(dá)均低于原牙髓干細(xì)胞和牙周膜干細(xì)胞，且re-PDLCs表達(dá)更低。 3.牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線和克隆形成率比較：DPSCs的增殖能力強(qiáng)于re-DPCs，其中DPSCs克隆形成率為24.3±1.2%，re-DPCs克隆形成率為23.8±1.3%，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。PDLSCs再生前后的生長(zhǎng)曲線和克隆形成率進(jìn)行比較，PDLSCs的增殖能力明顯強(qiáng)于re-PDLCs，其中PDLSCs克隆形成率為20.6±1.4%，re-DPCs克隆形成率為0%（P0.05）。 4.多向分化潛能 4.1牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨能力比較及成骨相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：成骨誘導(dǎo)8天ALP染色，堿性磷酸酶（AKP）定量測(cè)試分析示：DPSCs的ALP活性強(qiáng)于re-DPCs（P0.05）；成骨誘導(dǎo)4周后，茜素紅染色，十六烷基吡啶定量分析顯示，DPSCs成骨能力略強(qiáng)于re-DPCs，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP， COL-I及RUNX2顯示：DPSCs成骨能力強(qiáng)于re-DPCs，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05），而BSP及OCN基因的表達(dá)則無(wú)明顯差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。同樣檢測(cè)PDLSCs及re-PDLCs顯示： re-PDLCs的ALP活性明顯低于PDLSCs（P0.001），且成骨能力亦明顯低于PDLSCs （P0.001）；RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)基因ALP、BSP、 OCN、 COL-I和RUNX2顯示： PDLSCs成骨能力強(qiáng)于re-PDLCs，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0.05）。 4.2牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成脂能力比較及成脂相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：成脂分化誘導(dǎo)21天后油紅O染色，脂滴形成面積計(jì)算顯示：DPSCs成脂誘導(dǎo)分化能力略強(qiáng)于re-DPCs，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05），RT-PCR及Western Blot檢測(cè)成脂相關(guān)基因PPARγ也顯示DPSCs的成脂誘導(dǎo)分化能力略強(qiáng)于re-DPCs，但兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。同樣方法檢測(cè)PDLSCs和re-PDLCs誘導(dǎo)成脂分化能力顯示： PDLSCs誘導(dǎo)成脂分化能力略強(qiáng)于re-PDLCs，但兩者亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 4.3牙髓干細(xì)胞與再生后牙髓樣細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞與再生后牙周膜樣細(xì)胞體外誘導(dǎo)成軟骨分化能力比較及成軟骨分化相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)：成軟骨分化誘導(dǎo)8周，HE染色顯示：DPSCs成軟骨分化能力強(qiáng)于re-DPCs （P0.05）；RT-PCR及WesternBlot檢測(cè)成軟骨分化相關(guān)基因COL-II和ACAN顯示，DPSCs成軟骨分化能力強(qiáng)于re-DPCs（P0.05）。同樣檢測(cè)PDLSCs和re-PDLCs顯示：PDLSCs成軟骨分化能力明顯強(qiáng)于re-PDLCs （P0.001）。 結(jié)論： 1：牙髓干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞具有成脂、成骨及成軟骨誘導(dǎo)分化能力，且可以異位再生出類牙髓樣組織和類牙周膜樣組織。 2：從再生出的組織中分離出的re-DPCs和re-PDLCs分別與再生前DPSCs和PDLSCs比較發(fā)現(xiàn)：re-DPCs和re-PDLCs體外仍具有一定的自我增殖能力和多向分化分化潛能，表明兩種干細(xì)胞異位再生后仍然維持著一定的干細(xì)胞特性。 3：細(xì)胞移植促進(jìn)組織再生后，其中仍然存在著具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的細(xì)胞，尤其是在再生后牙髓樣組織中，這意味著異位再生過(guò)程中DPSCs保持的自我更新和分化能力較PDLSCs強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2437600