【摘要】：牙周疾病治療的最終目標(biāo)是使得已經(jīng)發(fā)生破壞的牙周支持組織實(shí)現(xiàn)再生和修復(fù)。牙周膜是牙周支持組織的組成部分之一,而牙周膜細(xì)胞(periodontal ligament cell,PDLC)是牙周膜的主要組成細(xì)胞,是一個由多種細(xì)胞組成的異質(zhì)性細(xì)胞群,主要包括:成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及未分化的間充質(zhì)細(xì)胞。牙周膜細(xì)胞具有增殖及多向分化的潛能,其自我更新能力在牙周組織再生過生中發(fā)揮著重要的作用。血小板濃縮制品可由自身全血制備而來,是自體源性生長因子的主要來源之一,在臨床治療和實(shí)驗(yàn)研究中被廣泛應(yīng)用,其中富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)和濃縮生長因子(concentrate growth factors,CGF)較為常見。PRP和CGF作為自體血小板的濃縮制品,富含多種生長因子,可促進(jìn)創(chuàng)傷愈合過程中細(xì)胞的聚集、增殖和分化,促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的生物合成,調(diào)控著創(chuàng)傷愈合的過程。目前,PRP的實(shí)驗(yàn)研究較多、臨床應(yīng)用時間較長,而對CGF的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用相對較少。因此,本文旨在研究PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化的影響。第一部分全血、PRP、CGF中生長因子的對比研究目的對比研究全血、PRP和CGF中生長因子轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血小板源性生長因子(PDGF)的水平。方法選取8名健康年輕志愿者,每人抽取肘靜脈全血25 mL,實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)全血組(5mL全血,加入EDTA抗凝劑);(2)PRP組(10mL全血,加入EDTA抗凝劑);(3)CGF組(10 mL全血,未加抗凝劑)。對3個組分別進(jìn)行血小板計(jì)數(shù),ELISA檢測其中生長因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平。結(jié)果1.與全血相比,PRP中血小板數(shù)量達(dá)到全血的6倍以上;CGF血小板計(jì)數(shù)結(jié)果顯示無法檢測出。2.與全血相比,PRP中生長因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平明顯升高(P0.05);而與全血相比,CGF中生長因子TGF-β1和PDGF的水平稍增高,VEGF濃度水平下降,但不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論P(yáng)RP、CGF中生長因子TGF-β1和PDGF水平均增高,PRP中VEGF水平增高,而CGF中VEGF水平下降;PRP中生長因子水平增高明顯(P0.05),CGF中生長因子水平增高不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。第二部分人牙周膜細(xì)胞(hPDLCs)的體外分離培養(yǎng)及其增殖、多向分化潛能的研究目的掌握人牙周膜細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法,研究其增殖、多向分化的潛能。方法1.收集健康第三磨牙(無齲壞、牙周炎及根尖周炎),采用酶消化結(jié)合組織塊法進(jìn)行人牙周膜細(xì)胞的分離培養(yǎng),選取第2代細(xì)胞通過免疫組化行角蛋白、波形絲蛋白染色,鑒定人牙周膜細(xì)胞來源。2.選取人牙周膜細(xì)胞第4-6代進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn),以1 ×10~5/mL和0.8 ×10~5/mL的密度接種于培養(yǎng)皿,MTT法、CCK-8法研究人牙周膜細(xì)胞的增殖能力。3.人牙周膜細(xì)胞進(jìn)行礦化誘導(dǎo)、脂化誘導(dǎo),分別進(jìn)行茜素紅染色和油紅O染色,研究人牙周膜細(xì)胞的多向分化潛能。結(jié)果1.鏡下觀察見:人牙周膜細(xì)胞呈長梭形、胞體豐滿、胞漿均勻,細(xì)胞呈漩渦狀、柵欄狀排列。2.免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:波形蛋白陽性,角蛋白陰性。3.MTT法、CCK-8法顯示:人牙周膜細(xì)胞的生長曲線基本呈S形。4.茜素紅染色、油紅O染色顯示:人牙周膜細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后,可見礦化結(jié)節(jié)和脂滴形成。結(jié)論人牙周膜細(xì)胞可通過酶消化結(jié)合組織塊法進(jìn)行體外的分離培養(yǎng);且具有增殖和多向分化的潛能。第三部分 PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化影響的研究目的研究PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化的影響。方法選取人牙周膜細(xì)胞第4-6代用于實(shí)驗(yàn)。1.細(xì)胞以1 × 10~5/mL的密度接種,含有10%FBS的DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,制造直徑約8 mm的細(xì)胞缺失區(qū)域。實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)Con組:基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);(2)PRP組:以含有5%PRP的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);(3)CGF組:以含有5%CGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。每實(shí)驗(yàn)組于培養(yǎng)的第1、4、7、10、13 d隨機(jī)選一皿進(jìn)行結(jié)晶紫染色,檢測PRP、CGF對人牙周膜細(xì)胞增殖的影響。2.細(xì)胞以1 × 10~5/mL的密度接種,含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,換為不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)Con組:以不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)PRP組:含有不同的濃度PRP(1%、5%、10%)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng);(3)CGF組:含有不同濃度CGF(1%、5%、10%)的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分別培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞24 h、48 h和72 h,分別提取24 h、48 h、72 h的細(xì)胞總蛋白。蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測與成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、DIx5 和 Msx2 的表達(dá)。結(jié)果1.與Con組對比,PRP、CGF促進(jìn)了人牙周膜細(xì)胞的增殖。2.不同的刺激時間,同樣濃度的PRP、CGF刺激hPDLCs,WB結(jié)果顯示:Runx2、Osx、DIx5隨著刺激時間的增加,蛋白表達(dá)量增加,呈時間依賴性,在72 h達(dá)到最高;Msx2蛋白表達(dá)量在24h時相對最高。不同濃度的PRP、CGF分別刺激hPDLCs相同的時間,WB結(jié)果顯示:在同樣刺激時間下,Runx2、Osx、DIx5蛋白隨著PRP、CGF刺激濃度的增加,蛋白表達(dá)量增加,在10%濃度時達(dá)到最高;Msx2蛋白隨著PRP、CGF刺激濃度的增加,蛋白表達(dá)量降低。結(jié)論P(yáng)RP、CGF可以促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的增殖、成骨分化:促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子Runx2、Osx、DIx5的表達(dá),抑制轉(zhuǎn)錄因子Msx2的表達(dá),具有時間和劑量依賴性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4

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本文編號：2401834