【摘要】：牙周疾病治療的最終目標是使得已經發(fā)生破壞的牙周支持組織實現再生和修復。牙周膜是牙周支持組織的組成部分之一,而牙周膜細胞(periodontal ligament cell,PDLC)是牙周膜的主要組成細胞,是一個由多種細胞組成的異質性細胞群,主要包括:成骨細胞、破骨細胞、成纖維細胞以及未分化的間充質細胞。牙周膜細胞具有增殖及多向分化的潛能,其自我更新能力在牙周組織再生過生中發(fā)揮著重要的作用。血小板濃縮制品可由自身全血制備而來,是自體源性生長因子的主要來源之一,在臨床治療和實驗研究中被廣泛應用,其中富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)和濃縮生長因子(concentrate growth factors,CGF)較為常見。PRP和CGF作為自體血小板的濃縮制品,富含多種生長因子,可促進創(chuàng)傷愈合過程中細胞的聚集、增殖和分化,促進細胞外基質的生物合成,調控著創(chuàng)傷愈合的過程。目前,PRP的實驗研究較多、臨床應用時間較長,而對CGF的實驗研究和臨床應用相對較少。因此,本文旨在研究PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化的影響。第一部分全血、PRP、CGF中生長因子的對比研究目的對比研究全血、PRP和CGF中生長因子轉化生長因子β1(TGF-β1)、血管內皮生長因子(VEGF)和血小板源性生長因子(PDGF)的水平。方法選取8名健康年輕志愿者,每人抽取肘靜脈全血25 mL,實驗分為3組:(1)全血組(5mL全血,加入EDTA抗凝劑);(2)PRP組(10mL全血,加入EDTA抗凝劑);(3)CGF組(10 mL全血,未加抗凝劑)。對3個組分別進行血小板計數,ELISA檢測其中生長因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平。結果1.與全血相比,PRP中血小板數量達到全血的6倍以上;CGF血小板計數結果顯示無法檢測出。2.與全血相比,PRP中生長因子TGF-β1、VEGF和PDGF的水平明顯升高(P0.05);而與全血相比,CGF中生長因子TGF-β1和PDGF的水平稍增高,VEGF濃度水平下降,但不具有統(tǒng)計學差異。結論PRP、CGF中生長因子TGF-β1和PDGF水平均增高,PRP中VEGF水平增高,而CGF中VEGF水平下降;PRP中生長因子水平增高明顯(P0.05),CGF中生長因子水平增高不具有統(tǒng)計學差異。第二部分人牙周膜細胞(hPDLCs)的體外分離培養(yǎng)及其增殖、多向分化潛能的研究目的掌握人牙周膜細胞的體外分離培養(yǎng)方法,研究其增殖、多向分化的潛能。方法1.收集健康第三磨牙(無齲壞、牙周炎及根尖周炎),采用酶消化結合組織塊法進行人牙周膜細胞的分離培養(yǎng),選取第2代細胞通過免疫組化行角蛋白、波形絲蛋白染色,鑒定人牙周膜細胞來源。2.選取人牙周膜細胞第4-6代進行后續(xù)的實驗,以1 ×10~5/mL和0.8 ×10~5/mL的密度接種于培養(yǎng)皿,MTT法、CCK-8法研究人牙周膜細胞的增殖能力。3.人牙周膜細胞進行礦化誘導、脂化誘導,分別進行茜素紅染色和油紅O染色,研究人牙周膜細胞的多向分化潛能。結果1.鏡下觀察見:人牙周膜細胞呈長梭形、胞體豐滿、胞漿均勻,細胞呈漩渦狀、柵欄狀排列。2.免疫細胞化學染色顯示:波形蛋白陽性,角蛋白陰性。3.MTT法、CCK-8法顯示:人牙周膜細胞的生長曲線基本呈S形。4.茜素紅染色、油紅O染色顯示:人牙周膜細胞經過誘導后,可見礦化結節(jié)和脂滴形成。結論人牙周膜細胞可通過酶消化結合組織塊法進行體外的分離培養(yǎng);且具有增殖和多向分化的潛能。第三部分 PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化影響的研究目的研究PRP、CGF對hPDLCs增殖、成骨分化的影響。方法選取人牙周膜細胞第4-6代用于實驗。1.細胞以1 × 10~5/mL的密度接種,含有10%FBS的DMEM作為基礎培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,制造直徑約8 mm的細胞缺失區(qū)域。實驗分為3組:(1)Con組:基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng);(2)PRP組:以含有5%PRP的基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng);(3)CGF組:以含有5%CGF的基礎培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。每實驗組于培養(yǎng)的第1、4、7、10、13 d隨機選一皿進行結晶紫染色,檢測PRP、CGF對人牙周膜細胞增殖的影響。2.細胞以1 × 10~5/mL的密度接種,含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,換為不含FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。實驗分為3組:(1)Con組:以不含FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng);(2)PRP組:含有不同的濃度PRP(1%、5%、10%)的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng);(3)CGF組:含有不同濃度CGF(1%、5%、10%)的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。實驗分別培養(yǎng)人牙周膜細胞24 h、48 h和72 h,分別提取24 h、48 h、72 h的細胞總蛋白。蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測與成骨相關轉錄因子Runx2、Osx、DIx5 和 Msx2 的表達。結果1.與Con組對比,PRP、CGF促進了人牙周膜細胞的增殖。2.不同的刺激時間,同樣濃度的PRP、CGF刺激hPDLCs,WB結果顯示:Runx2、Osx、DIx5隨著刺激時間的增加,蛋白表達量增加,呈時間依賴性,在72 h達到最高;Msx2蛋白表達量在24h時相對最高。不同濃度的PRP、CGF分別刺激hPDLCs相同的時間,WB結果顯示:在同樣刺激時間下,Runx2、Osx、DIx5蛋白隨著PRP、CGF刺激濃度的增加,蛋白表達量增加,在10%濃度時達到最高;Msx2蛋白隨著PRP、CGF刺激濃度的增加,蛋白表達量降低。結論PRP、CGF可以促進人牙周膜細胞的增殖、成骨分化:促進轉錄因子Runx2、Osx、DIx5的表達,抑制轉錄因子Msx2的表達,具有時間和劑量依賴性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4

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本文編號：2401834