【摘要】：自從Branemark提出骨整合這一概念以來，鈦種植體作為缺牙修復(fù)的治療手段，顯著提高了患者的生存質(zhì)量。種植體骨結(jié)合是種植體成功行使功能的重要影響因素[1,2]。種植體表面的理化性能在種植體骨結(jié)合中起到重要作用[3-6]，從組織學(xué)和細(xì)胞水平探討種植體與骨結(jié)合過程已成為關(guān)注的熱點(diǎn)�，F(xiàn)階段的研究表明：純鈦表面形貌[7-9]、粗糙度[10-12]、親水性[13-17]及理化特性均對(duì)細(xì)胞的增殖和分化產(chǎn)生重要影響，進(jìn)而影響種植體的骨整合[8,18]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSCs）具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，已被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域。許多研究者都將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨修復(fù)的成骨分化來源細(xì)胞[19,20]。本研究用梯度濃度NaOH溶液對(duì)純鈦試件進(jìn)行堿處理，觀察不同濃度NaOH溶液處理對(duì)純鈦試件表面納米結(jié)構(gòu)及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響。將制備的純鈦試件打磨至2000目。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行梯度濃度（2.5M，5M，7.5M，10M，12.5M）NaOH溶液處理。用掃描電子顯微鏡(SEM)、掃描探針顯微鏡(SPM)對(duì)改性后實(shí)驗(yàn)組的表面形態(tài)觀察分析,能量色散X射線光譜儀(EDX)分析表面元素組成及各元素所占比例。用體外骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)的方法觀察堿處理后純鈦試件不同表面對(duì)細(xì)胞黏附、增殖、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶(ALP)活性和細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）礦物質(zhì)沉積的影響，用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析(ELISA)測(cè)定骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量，用RT-PCR方法檢測(cè)了不同表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨相關(guān)基因的表達(dá)。 結(jié)果如下： 1.堿處理后的各實(shí)驗(yàn)組純鈦試件表面均形成了形貌相似的多孔納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。高倍SEM圖像顯示不同濃度NaOH溶液處理后純鈦試件表面的形貌細(xì)節(jié)，此相似的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的大小從2.5M組到10M組逐漸減小，在最高濃度12.5M組已不能形成均勻的納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。AFM檢測(cè)的表面粗糙度（Ra）也呈現(xiàn)出相似的趨勢(shì)，從2.5M組到10M組逐漸減小，但12.5M組較10M組略有增大。接觸角隨著堿處理濃度的升高由40°降到6°，但在12.5M組略有升高。堿處理后試件經(jīng)X線能譜（EDX）檢測(cè)分析，結(jié)果顯示其表面主要成分為Ti元素及微量的Na和Si元素。各實(shí)驗(yàn)組間Na元素含量無明顯差異。 2.試件蛋白吸收檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的蛋白吸收明顯優(yōu)于對(duì)照組，且隨著堿溶液濃度的增加而增加，10M組達(dá)到頂峰，12.5M組略有下降。 3.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組試件表面在30min、1h和3h的早期黏附明顯高于對(duì)照組試件表面。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)組試件表面的早期增殖也明顯高于對(duì)照組試件表面，且細(xì)胞在10M組的增殖能力最強(qiáng)。 4.細(xì)胞短期培養(yǎng)30min、1h、3h后，細(xì)胞形態(tài)呈相似的紡錘體狀，但偽足的伸展表現(xiàn)出顯著的差異。實(shí)驗(yàn)組試件表面培養(yǎng)細(xì)胞偽足的數(shù)量和長度隨堿處理濃度的增加而增加，10M處理組試件表面培養(yǎng)細(xì)胞偽足數(shù)量及伸展長度表現(xiàn)最好。細(xì)胞經(jīng)過3d的培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組試樣表面培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)已發(fā)生改變。對(duì)照組的細(xì)胞還保持著紡錘體形態(tài)，且板狀偽足的數(shù)量也較少。實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞已經(jīng)鋪展，且伸展出較多的板狀偽足。 5.1w和2w的ALP染色及ALP活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組有顯著差異。3w和4w的茜素紅染色，細(xì)胞外基質(zhì)礦物質(zhì)沉淀以及酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)分析(ELISA)測(cè)定骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量，，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組間也表現(xiàn)出顯著差異。 6.3d和7d的RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組表面骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的骨涎蛋白(BSP)、骨結(jié)合素(ON)、2型轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(RUNX2)、I型膠原(Co1-I)的表達(dá)均較對(duì)照組均顯著提高。 結(jié)論：純鈦試件表面經(jīng)堿（NaOH）處理后形成納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)的大小、表面粗糙度、濕潤性及蛋白吸附能力均與堿處理濃度的濃度有關(guān)。此納米網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)顯著地影響了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為如：黏附、增殖、ALP活性、細(xì)胞外基質(zhì)礦物質(zhì)沉淀、骨鈣素(OCN)的產(chǎn)出量以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)。這些指標(biāo)均在NaOH濃度達(dá)到10M時(shí)升到峰值。本研究結(jié)果為下一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為以后的臨床應(yīng)用提供理論支持。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R783.6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2381529