【摘要】：目的：涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC），是一種口腔頜面外科最常見的惡性涎腺上皮來源性腫瘤。它有嗜神經血管性生長特點，有著較強的局部侵襲性，因而容易發(fā)生血行性遠處轉移等生物學特性；同時該病惡性程度高，對于放射治療的敏感性卻較低。正因為如此，該腫瘤手術切除后具有較高的局部復發(fā)率和遠處轉移率，其遠端轉移率居口腔頜面部首位。然而，涎腺腺樣囊性癌的發(fā)病及其轉移機制目前仍不十分清楚。因而探索新的治療方法，，來提高對腺樣囊性癌的治療效果，減少局部復發(fā)和遠處轉移的幾率，改善患者的生存質量就更顯得尤為重要。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一種天然存在于十字花科蔬菜中屬于異硫氰酸鹽（isothiocyanates，ITCS)類的物質。該類物質具有強抗癌作用，近些年來相繼有研究報道萊菔硫烷具有抗腫瘤作用，我們前期的體外實驗表明，萊菔硫烷能夠抑制腺樣囊性癌細胞系ACC-M的增殖，觸發(fā)由Caspase介導的凋亡，并且Bcl-2家族成員在凋亡中起重要作用。但是在體內環(huán)境中，萊菔硫烷能否抑制腺樣囊性癌的生長，國內外未見報道。本次實驗中，我們采用了人肺高轉移性涎腺腺樣囊性癌細胞系ACC-M進行裸鼠的皮下接種，建立了裸鼠移植瘤模型，通過口服給予適宜劑量的萊菔硫烷后，觀察萊菔硫烷對人涎腺腺樣囊性癌體內移植瘤模型是否具有抑制增殖和誘導其凋亡的作用，探討其可能的分子作用機制，旨在為腺樣囊性癌的多模式治療中拓展新的植物化學藥物治療途徑提供相關的實驗資料。 方法： 1材料 1.1人涎腺腺樣囊性癌細胞株ACC-M:由中國上海交通大學口腔頜面外科實驗室提供，該細胞系建立于1995年。 1.2萊菔硫烷（SFN）：美國匹茲堡大學醫(yī)學中心頭頸外科提供，購自LKT實驗室，純度≥99%。 1.3裸鼠：北京軍事醫(yī)學科學院動物實驗中心提供，10只雄性裸鼠，4~6周齡，體重16~20克。 1.4原位細胞凋亡檢測試劑盒:購自美國ROCHE公司 1.5DAB檢測試劑盒：購于河北博海生物工程有限公司 2實驗方法 2.1藥液配制：萊菔硫烷用磷酸鹽緩釋液PBS稀釋成100mmol/L濃度的儲存液，冰凍于-20℃冰箱中。 2.2細胞培養(yǎng)：將凍存的ACC-M細胞系予以復蘇，培養(yǎng)液均采用RPMI1640加入10%的胎牛血清和青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL）按比例配制，將復蘇后的細胞置于37℃、5%CO2恒溫恒濕箱內培養(yǎng)，隔天換液，約72~96h后可以傳代。 2.3細胞接種及動物模型的建立：細胞長至對數生長期，收集并調整細胞密度為2×107/ml的細胞懸液。將ACC-M細胞懸液接種于10只裸小鼠背部皮下,每只選擇左前背部和右后背部2個注射點,每點注射0.2ml。 2.4分組給藥：荷瘤鼠隨機分為A、B兩組，每組5只。A組為實驗組，應用SFN，B組為對照組，應用PBS。注射前常規(guī)以碘酊消毒注射區(qū)皮膚，兩組均采用經口腔給藥，腫瘤接種當天開始給藥，3次/周（周一，周三，周五），連續(xù)三周。A組每次給予60mmol/L的SFN0.1ml，B組每次給予相同劑量的PBS。每次給藥時觀察裸鼠的精神狀態(tài)、飲食、飲水及活動并測量裸鼠體重和腫瘤體積。 2.5腫瘤體積的測量和腫瘤生長抑制率的計算：每次給藥后用卡尺測量移植瘤長徑（a）、短徑（b）及高（c），同時計算腫瘤的體積，計算公式為：腫瘤體積V=π×a×b×c/6,繪制腫瘤生長曲線；計算腫瘤的生長抑制率，公式為：抑瘤率=對照組平均體積－用藥組平均體積／對照組平均體積×100%。在結束給藥后的第二天（即第23天），通過頸椎脫臼的方法處死裸鼠，并用碘伏消毒，眼科鉗、手術刀快速剝離瘤體組織，除去瘤體表面的壞死組織等。測量各組移植瘤直徑，電子天平稱瘤重。 2.6用TUNEL法檢測裸鼠移植瘤細胞的凋亡：將人腺樣囊性癌細胞裸鼠移植瘤的組織標本，用4%多聚甲醛液固定24個小時，然后用石蠟包埋瘤體組織作冠狀面切片，每個組織標本切2張，標本組織切片經過二甲苯的脫蠟和梯度乙醇脫水后，依據TUNEL法，在脫氧核苷酸末端轉移酶的作用下，將生物素化的dUTP標記至DNA斷裂后形成3’-OH末端，并將過氧化物酶憑借親和素和生物素的特異性結合，連接至DNA斷點，最后加入底物，通過3,3-二胺基聯(lián)苯胺（DAB）顯色。 2.7結果判定：光鏡下可觀察到細胞核棕黃色著色的凋亡細胞。MoticMed6.0圖像分析系隨機拍攝10個400倍（10個目鏡×40物鏡）視野，腫瘤細胞核呈藍色，凋亡陽性細胞為棕黃色，對每張切片進行評價，陽性細胞計數進行免疫組織化學評分（IHS）。為了數據統(tǒng)計和分析的方便，把陰性與弱陽性均歸為陰性組，中等陽性與強陽性均歸為陽性組。 2.8統(tǒng)計學分析:腫瘤體積和重量的數據用平均數±標準差表示,采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行t檢驗分析。TUNEL法的免疫組織化學評分按實驗數據應用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件進行χ2檢驗及Fisher精確概率法分析組間差異，P0.05定為統(tǒng)計學差異有顯著性。 結果： 結果顯示：SFN處理移植瘤后，SFN對人腺樣囊性癌裸鼠移植瘤有明顯的抑制作用，兩組瘤體大小，重量有明顯差別。成瘤后，不同時間點實驗組瘤塊的平均體積顯著小于對照組。實驗組裸鼠體重與對照組相比無明顯差異。TUNEL染色顯示，實驗組TUNEL陽性率明顯高于對照組。 結論： 1萊菔硫烷可抑制腺樣囊性癌ACC-M裸鼠體內移植瘤的增殖生長。 2萊菔硫烷可體內誘導腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤的凋亡。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.8

【參考文獻】

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本文編號：2354536