發(fā)布時間：2018-11-19 21:59

【摘要】：目的利用RNAi技術對整合素轉接激酶（integrin-linked kinase，ILK）基因表達進行特異性沉默，觀察并檢測ILK siRNA對體內和體外人舌鱗癌細胞的形態(tài)，生長，凋亡，侵襲和轉移的等的影響，并對沉默ILK基因表達后EMT信號通路的調控分子機制進行探討。 方法將特異性ILK siRNA表達載體及無同源性的對照載體，在脂質體介導下分別穩(wěn)定轉染兩種人舌鱗癌TCA8113細胞及Tb細胞，分為TCA8113組、TCA8113vector組、TCA8113siILK組，Tb組、Tbvector組、Tb siILK組，通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達ILK siRNA的細胞后，，使用western blot及免疫熒光方法檢測ILK的表達；構建裸鼠移植瘤模型；用MTT法檢測細胞的增殖能力；以劃痕試驗檢測細胞的運動遷移能力；以Transwell法檢測細胞的侵襲能力；使用流式細胞儀來分析細胞周期及凋亡情況；用western blot及免疫熒光方法分析在體外及體內實驗中ILK下游底物分子Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β的表達；用western blot檢測與細胞粘附相關的MMP2、MMP9和EMT相關的N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表達；光學顯微鏡下觀察移植瘤組織切片微血管密度的變化；以CD31抗體進行免疫熒光染色觀察移植瘤組織切片微血管密度的變化；光學顯微鏡下觀察動物模型肺組織切片自發(fā)性轉移瘤的情況；免疫組織化學檢測移植瘤組織中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達；HE染色及免疫組織化學檢測人舌鱗癌臨床標本中ILK、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達。 結果經G418篩選獲得穩(wěn)定表達細胞株后，通過Western Blot及免疫熒光檢測證實實驗組細胞的ILK蛋白表達被沉默。形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)TCA8113siILK/Tb siILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞的上皮形態(tài)特征更為明顯，細胞核較小，分裂相減少，胞漿嗜堿性較弱，表明其惡性程度較低。MTT結果提示TCA8113siILK/Tb siILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞的生長能力顯著降低。劃痕試驗結果顯示TCA8113siILK/Tb siILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞的遷移能力明顯下降。Transwell實驗顯示TCA8113siILK/Tb siILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞的侵襲能力明顯減弱。流式細胞儀分析結果發(fā)現(xiàn)TCA8113siILK/Tb siILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞的細胞周期發(fā)生G2-M期和G0-G1期阻滯，但細胞凋亡沒有發(fā)生明顯的變化。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，TCA8113siILK/TbsiILK組細胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表達明顯減少，而Akt和GSK3β的表達則沒有明顯變化，Western Blot顯示， TCA8113siILK/Tb siILK組細胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist的表達與對照組相比顯著減少（P0.05），E-cadherin的表達顯著增加（P0.05）。動物移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，實驗組裸鼠的瘤重與對照組相比顯著降低（P0.05），瘤組織中的血管密度明顯減小，同時瘤組織中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達表達呈弱陽性或陰性表達， E-cadherin呈強陽性表達。實驗組裸鼠肺中未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉移瘤，而對照組肺中均發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉移瘤。對人舌鱗癌臨床標本的免疫組化檢查結果，與動物實驗的發(fā)現(xiàn)相一致。 結論成功地在兩種人舌鱗癌細胞中轉染ILK siRNA表達質粒，并經G418篩選獲得穩(wěn)定表達的細胞，沉默ILK基因的表達抑制其下游底物分子Akt和GSK3β的磷酸化，并抑制與轉移相關蛋白MMP2和MMP9以及與EMT相關蛋白如N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表達，抑制人舌鱗癌TCA8113/Tb細胞的遷移和侵襲及轉移能力，并使細胞發(fā)生G2-M期和G0-G1期阻滯從而抑制細胞的生長。動物實驗證實沉默ILK基因后能夠有效的抑制人舌鱗癌TCA8113/Tb細胞在體內的生長和轉移的能力，其機制可能與沉默ILK基因后抑制了與EMT相關蛋白表達及通過ILK/Akt/GSK3β/Snail通路有關。故ILK可作為治療人舌鱗癌的靶蛋白。
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【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.85

【參考文獻】

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1 潘燕;韓婧;張曄;李學軍;;Vimentin在腫瘤轉移中的作用及藥物研究進展[J];生理科學進展;2010年06期

2 吳軍正,陳建元,李峰,李焰,張洪;舌癌腦轉移細胞系Tb的建立及形態(tài)和生長特性[J];實用口腔醫(yī)學雜志;1999年06期

3 何榮根,徐秀祺,周曉健,張秀麗,邱蔚六,張錫澤,劉嬡如,劉楨,韓玉升,胥彬,沈祖銘,韓家嫻,許良中,劉亦法;人舌鱗狀細胞癌Tca8113細胞系的建立及其生物學特性[J];腫瘤;1983年03期

本文編號：2343542