【摘要】：目的利用RNAi技術(shù)對(duì)整合素轉(zhuǎn)接激酶（integrin-linked kinase，ILK）基因表達(dá)進(jìn)行特異性沉默，觀察并檢測ILK siRNA對(duì)體內(nèi)和體外人舌鱗癌細(xì)胞的形態(tài)，生長，凋亡，侵襲和轉(zhuǎn)移的等的影響，并對(duì)沉默ILK基因表達(dá)后EMT信號(hào)通路的調(diào)控分子機(jī)制進(jìn)行探討。 方法將特異性ILK siRNA表達(dá)載體及無同源性的對(duì)照載體，在脂質(zhì)體介導(dǎo)下分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種人舌鱗癌TCA8113細(xì)胞及Tb細(xì)胞，分為TCA8113組、TCA8113vector組、TCA8113siILK組，Tb組、Tbvector組、Tb siILK組，通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)ILK siRNA的細(xì)胞后，，使用western blot及免疫熒光方法檢測ILK的表達(dá)；構(gòu)建裸鼠移植瘤模型；用MTT法檢測細(xì)胞的增殖能力；以劃痕試驗(yàn)檢測細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)遷移能力；以Transwell法檢測細(xì)胞的侵襲能力；使用流式細(xì)胞儀來分析細(xì)胞周期及凋亡情況；用western blot及免疫熒光方法分析在體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中ILK下游底物分子Akt、GSK3β、p-Akt、p-GSK3β的表達(dá)；用western blot檢測與細(xì)胞粘附相關(guān)的MMP2、MMP9和EMT相關(guān)的N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表達(dá)；光學(xué)顯微鏡下觀察移植瘤組織切片微血管密度的變化；以CD31抗體進(jìn)行免疫熒光染色觀察移植瘤組織切片微血管密度的變化；光學(xué)顯微鏡下觀察動(dòng)物模型肺組織切片自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤的情況；免疫組織化學(xué)檢測移植瘤組織中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達(dá)；HE染色及免疫組織化學(xué)檢測人舌鱗癌臨床標(biāo)本中ILK、E-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達(dá)。 結(jié)果經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株后，通過Western Blot及免疫熒光檢測證實(shí)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的ILK蛋白表達(dá)被沉默。形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞的上皮形態(tài)特征更為明顯，細(xì)胞核較小，分裂相減少，胞漿嗜堿性較弱，表明其惡性程度較低。MTT結(jié)果提示TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞的生長能力顯著降低。劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞的遷移能力明顯下降。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞的侵襲能力明顯減弱。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞的細(xì)胞周期發(fā)生G2-M期和G0-G1期阻滯，但細(xì)胞凋亡沒有發(fā)生明顯的變化。免疫熒光結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TCA8113siILK/TbsiILK組細(xì)胞較TCA8113/Tb組和TCA8113vector/Tb vector組細(xì)胞中ILK、p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)明顯減少，而Akt和GSK3β的表達(dá)則沒有明顯變化，Western Blot顯示， TCA8113siILK/Tb siILK組細(xì)胞中MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist的表達(dá)與對(duì)照組相比顯著減少（P0.05），E-cadherin的表達(dá)顯著增加（P0.05）。動(dòng)物移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組裸鼠的瘤重與對(duì)照組相比顯著降低（P0.05），瘤組織中的血管密度明顯減小，同時(shí)瘤組織中ILK、MMP2、MMP9、N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist蛋白表達(dá)表達(dá)呈弱陽性或陰性表達(dá)， E-cadherin呈強(qiáng)陽性表達(dá)。實(shí)驗(yàn)組裸鼠肺中未發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤，而對(duì)照組肺中均發(fā)現(xiàn)自發(fā)性轉(zhuǎn)移瘤。對(duì)人舌鱗癌臨床標(biāo)本的免疫組化檢查結(jié)果，與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)相一致。 結(jié)論成功地在兩種人舌鱗癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ILK siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并經(jīng)G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞，沉默ILK基因的表達(dá)抑制其下游底物分子Akt和GSK3β的磷酸化，并抑制與轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白MMP2和MMP9以及與EMT相關(guān)蛋白如N-cadherin、β-catenin、Snail、Slug、Vimentin和Twist等的表達(dá)，抑制人舌鱗癌TCA8113/Tb細(xì)胞的遷移和侵襲及轉(zhuǎn)移能力，并使細(xì)胞發(fā)生G2-M期和G0-G1期阻滯從而抑制細(xì)胞的生長。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)沉默ILK基因后能夠有效的抑制人舌鱗癌TCA8113/Tb細(xì)胞在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移的能力，其機(jī)制可能與沉默ILK基因后抑制了與EMT相關(guān)蛋白表達(dá)及通過ILK/Akt/GSK3β/Snail通路有關(guān)。故ILK可作為治療人舌鱗癌的靶蛋白。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.85

【參考文獻(xiàn)】

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1 潘燕;韓婧;張曄;李學(xué)軍;;Vimentin在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及藥物研究進(jìn)展[J];生理科學(xué)進(jìn)展;2010年06期

2 吳軍正,陳建元,李峰,李焰,張洪;舌癌腦轉(zhuǎn)移細(xì)胞系Tb的建立及形態(tài)和生長特性[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;1999年06期

3 何榮根,徐秀祺,周曉健,張秀麗,邱蔚六,張錫澤,劉嬡如,劉楨,韓玉升,胥彬,沈祖銘,韓家嫻,許良中,劉亦法;人舌鱗狀細(xì)胞癌Tca8113細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性[J];腫瘤;1983年03期

本文編號(hào)：2343542