【摘要】：顳下頜關(guān)節(jié)紊亂病(TMD)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)盤的退行性改變,而在此過程中顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)滑膜襯里層中的成纖維樣滑膜細胞(FLSs)功能異�；虻蛲�,導(dǎo)致滑膜失去正常分泌功能。FLSs在滑膜細胞中占絕大多數(shù),存在于滑膜襯里中并呈三至四層的排列結(jié)構(gòu)。正常時FLSs胞膜上的透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)合成透明質(zhì)酸(HA), FLSs負責(zé)滑膜組織的正常分泌功能,營養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨；而在TMD時FLSs的分泌功能異常(例如分泌炎癥因子及基質(zhì)金屬降解酶類)或凋亡,導(dǎo)致滑膜正常分泌功能的喪失,繼而關(guān)節(jié)軟骨失去營養(yǎng),并遭受降解破壞。因而,構(gòu)建一個具有正常HA分泌功能的組織工程滑膜,替換病理性的滑膜組織,可能成為治療TMD的新方法。 根據(jù)溫敏細胞層技術(shù)構(gòu)建具有多層細胞結(jié)構(gòu)這一理論設(shè)計的滑膜細胞層不能準確地模擬滑膜襯里層的細胞層外基質(zhì)成分,因為細胞層技術(shù)依賴高密度細胞分泌的細胞外基質(zhì)將細胞粘結(jié)在一起,而Ⅰ型膠原占據(jù)滑膜膠原總量的一半,FLSs主要分泌HA,而非Ⅰ型膠原。因此,本研究擬通過一種新的方法構(gòu)建能夠模擬滑膜襯里層的多層結(jié)構(gòu)細胞層。本研究包括以下四個部分： 第一部分細胞培養(yǎng)及其鑒定 實驗一人類顳下頜關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細胞及真皮成纖維細胞的體外培養(yǎng) 目的：獲得人類顳下頜關(guān)節(jié)正常的FLSs及作為對照的人類真皮成纖維細胞,以供構(gòu)建細胞層使用。 方法：正�；そM織取自三位髁突骨折手術(shù)患者,真皮組織塊取自唇腭裂修復(fù)術(shù)的患者,使用組織塊法進行細胞培養(yǎng)。 結(jié)果：FLSs大約在3-5d時可從組織塊中爬出,呈梭形,2w后,細胞即可達到80%匯合,傳代后大約4d即可繼續(xù)傳代。真皮成纖維細胞活性較好,傳代后一般2-3d即可再次傳代。 結(jié)論：組織塊法培養(yǎng)兩種細胞,方法簡單,重復(fù)性高,細胞活性好,可用于后續(xù)實驗。 實驗二成纖維樣滑膜細胞與真皮成纖維細胞的免疫細胞化學(xué)鑒定 目的：鑒定FLSs及真皮成纖維細胞(DFs)。 方法：通過細胞免疫化學(xué)的方法鑒定上述兩種細胞。 結(jié)果：FLSs陽性表達vimentin, CD44, Hsp27,陰性表達CD14；真皮成纖維細胞陽性表達vimentin,陰性表達cytokeratin15. 結(jié)論：通過組織塊法培養(yǎng)的FLSs為B型滑膜細胞,真皮成纖維細胞為真皮來源而非上皮來源。 第二部分細胞層的構(gòu)建及其與天然滑膜的形態(tài)學(xué)對比觀察 實驗三甲基纖維素溶液的制備與凝膠溫度的測定 目的：測試逆向溫敏材料甲基纖維素(MC)的溫敏特性。 方法：制備含有不同濃度PBS及不同濃度MC的MC混合溶液,按照傾斜試管法測定其凝膠溫度(GT)。 結(jié)果：隨著MC濃度的增高,MC混合溶液的GT降低；增加PBS的濃度也能夠降低GT。實驗組"5%MC,8%PBS"的GT為20.5℃。 結(jié)論：實驗組"5%MC,8%PBS"的GT較適合,可用于后續(xù)實驗。 實驗四三層結(jié)構(gòu)細胞層的構(gòu)建 目的：使用新的方法構(gòu)建三層結(jié)構(gòu)的細胞。 方法：第一種方法通過一種原創(chuàng)的方式結(jié)合Ⅰ型膠原與FLSs;第二種方法先在孔板中心滴加MC,再在其上結(jié)合第一種方法制造三層結(jié)構(gòu)的細胞層。 結(jié)果：第一種無MC的細胞層制備方法穩(wěn)定,成功率高,而第二種有MC的細胞層制備方法不如第一種穩(wěn)定,偶爾Ⅰ型膠原會與孔壁提前分離。 結(jié)論：第一種制造三層結(jié)構(gòu)細胞層的方法,制作原料及獲取簡單,重復(fù)性高,可用于后續(xù)實驗。 實驗五細胞層與人類正常滑膜的形態(tài)學(xué)觀察 目的：尋找三層結(jié)構(gòu)滑膜細胞層與人類正�；さ男螒B(tài)學(xué)相似性。 方法：使用無MC的方法制造具有三層細胞結(jié)構(gòu)滑膜細胞層,收集正�；そM織。進行蘇木素伊紅(HE)染色及透射電鏡觀察。 結(jié)果：細胞層與正�；さ囊r里層均含有3～4層平行排列的高密度梭形細胞,相互接觸的細胞之間未見橋粒、半橋�；蚩p隙連結(jié)之類的細胞連結(jié)結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：三層結(jié)構(gòu)的細胞層與天然滑膜襯里層在形態(tài)學(xué)上的相似。 實驗六正�；づc顳下頜關(guān)節(jié)退行性變滑膜的形態(tài)學(xué)觀察 目的：對比分析人類正�；づcTMJ退行性變時滑膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。 方法：正�；碜�3位髁突骨折患者,病理性滑膜來自10位骨關(guān)節(jié)病患者,常規(guī)組織學(xué)處理,HE染色。 結(jié)果：正常滑膜襯里層由3～4的長梭形滑膜細胞組成。而退行性變時的滑膜呈現(xiàn)出幾種不同的表現(xiàn),襯里層可增厚至約10層細胞也可保持3～4層,抑或襯里層中的細胞凋亡大幅減少,滑膜下層大多情況可見血管增多,少數(shù)病例可正常。 結(jié)論：TMJ OA退行性變時滑膜襯里層在形態(tài)上異常,有待組織工程滑膜的替換修復(fù)。 第三部分細胞層的功能檢測 實驗七細胞層的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) 目的：檢測各種不同細胞層的HA分泌量 方法：分組為普通培養(yǎng)的FLSs(對照)、單層的FLSs細胞層、三層的FLSs細胞層以及三層的DFs細胞層,使用ELISA法測定培養(yǎng)基中HA的分泌量。 結(jié)果：三層FLSs細胞層的HA分泌量高于其他組,在第1d和第3d時,該組的HA分泌量分別是單層FLSs細胞層HA分泌量的2.53倍和3.27倍。 結(jié)論：FLSs具有分泌透明質(zhì)酸的功能,FLSs培養(yǎng)在Ⅰ型膠原上能分泌更多的HA。三層結(jié)構(gòu)的FLSs細胞層能分泌大約3倍的HA。 實驗八細胞增殖活性實驗 目的：比較不同培養(yǎng)方式的FLSs的細胞增殖活性。 方法：分組為普通培養(yǎng)FLSs.單層FLSs細胞層和三層FLSs細胞層,使用CCK-8法測定各組的細胞增殖活性。 結(jié)果：單層FLSs細胞層的OD值在第3d時高于普通培養(yǎng)組的OD值。三層FLSs細胞層的OD值在第1d和第3d時均顯著高于其他兩組。 結(jié)論：FLSs在Ⅰ型膠原上的增殖活性高于其在普通平板培養(yǎng)上的活性,FLSs在三層結(jié)構(gòu)細胞層的培養(yǎng)環(huán)境中具備增殖活性。 實驗九Realtime-PCR檢測HAS2基因在不同細胞層中的表達 目的：對比不同細胞層的HAS2基因表達情況。 方法：分組普通培養(yǎng)FLSs組、單層FLSs細胞層組、三層FLSs細胞層組及三層DFs細胞層組,通過Realtime-PCR法檢測各組HAS2基因的表達。 結(jié)果：HAS2的表達在單層FLSs細胞層中顯著高于普通培養(yǎng)組,HAS2表達在三層FLSs細胞層中表達量最高。 結(jié)論：Ⅰ型膠原能促進FLSs表達更高水平的HAS2基因,同時三層結(jié)構(gòu)細胞層的三維培養(yǎng)方式能使FLSs中HAS2基因表達最高。 實驗十RT-PCR檢測天然滑膜與人工滑膜HAS2基因的表達差異 目的：對比人類正常滑膜與三層FLSs細胞層(人工滑膜)在HAS2基因的表達。 方法：收集髁突骨折手術(shù)患者的滑膜組織,及三層FLSs細胞層,使用RT-PCR法檢測HAS2基因表達情況。 結(jié)果：HAS2基因在人工滑膜中的表達略高于其在人類滑膜中的表達,但二者沒有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)論：人工滑膜與人類滑膜在HAS2表達上無差異。 第四部分裸鼠皮下移植實驗 實驗十一細胞層的裸鼠皮下移植研究 目的：探索三層FLSs細胞層再裸鼠皮下環(huán)境中的存活及功能表達情況。 方法：將Ⅰ型膠原、脫細胞真皮及三層結(jié)構(gòu)的FLSs細胞層植入裸鼠皮下,1w及2w周處死,組織學(xué)與免疫組化處理觀察。 結(jié)果：1w時,Ⅰ型膠原與脫細胞真皮中的膠原遭受降解,三層FLSs與起支持作用的Ⅰ型膠原分離。2w時,對照組的植入物均降解消失,而在細胞層植入組,多層平行排列的細胞位于支持膠原表面,而支持膠原中有宿主成纖維細胞和血管的侵入。CD44與HAS2表達于支持膠原表面層狀排列的細胞中。HA表達于CD44陽性細胞的細胞外基質(zhì)中。 結(jié)論：三層結(jié)構(gòu)的FLSs細胞層在裸鼠皮下環(huán)境中,較對照組具有更強的抵抗膠原降解的能力。在體內(nèi)環(huán)境中FLS保持分化特性,具有合成與分泌HA的功能。 小結(jié) 本研究首次對顳下頜關(guān)節(jié)滑膜進行組織工程構(gòu)建,并使用了一種獨創(chuàng)的方法構(gòu)建滑膜細胞層,使得三層結(jié)構(gòu)的滑膜細胞層在形態(tài)上與天然顳下頜關(guān)節(jié)滑膜襯里層相似。功能檢測證實,三層結(jié)構(gòu)的滑膜細胞層具有合成與分泌透明質(zhì)酸的能力。裸鼠皮下移植實驗證實三層結(jié)構(gòu)的滑膜細胞層具有抗降解的能力,并保持分泌透明質(zhì)酸的功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R782.6

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前7條

1 李健,龍星,朱帆,楊雪超;顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞成骨潛能的實驗研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年02期

2 鄧天政;呂晶;楊捷緋;柯杰;;組織工程骨-軟骨復(fù)合組織體內(nèi)異位移植的研究[J];中國美容醫(yī)學(xué);2013年01期

3 劉陽;張燕中;陳瑾君;殷德民;曹穎;許志成;劉偉;崔磊;曹誼林;;血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞-聚羥基乙酸復(fù)合物置入裸鼠皮下構(gòu)建人工血管(英文)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2008年10期

4 黃建榮;李衛(wèi)平;劉尚禮;沈慧勇;李建華;韓運;楊睿;唐勇;;轉(zhuǎn)胰島素樣生長因子-Ⅰ基因軟骨細胞體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨[J];中華創(chuàng)傷雜志;2006年02期

5 李健,龍星,柯金,孟慶功,房維;顳下頜關(guān)節(jié)滑膜間充質(zhì)干細胞的分離與培養(yǎng)[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年05期

6 成少飛;楊岷;陳長志;葉清;薛松;;組織工程心臟瓣膜裸鼠體內(nèi)移植的實驗研究[J];組織工程與重建外科雜志;2008年04期

7 史衛(wèi)紅;高勝利;卞勇華;宋祥和;Greg Brothers;李玉華;吳建成;;IL-18抑制HepG2肝癌裸鼠皮下移植瘤的機制[J];中國老年學(xué)雜志;2013年02期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 廖明德;人表皮干細胞復(fù)合裸鼠脫細胞真皮支架構(gòu)建組織工程皮膚及移植的實驗研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2009年

，

本文編號：2311093